Strukturně specifická vazba proteinu p53, jeho mutant a homologů na DNA

Mgr. Kateřina Němcová, Ph.D.

Doctoral thesis

Structure-specific binding of protein p53, its mutant forms and homologues to DNA

Abstract:

V předkládané disertační práci jsou prezentovány výsledky několika tematických studií zaměřených na zkoumání problematiky strukturně specifických interakcí proteinů rodiny p53 s DNA, a to zejména standardní formy p53 (wt p53) o plné délce, různých „hot spot“ mutantních forem p53 (mut p53) a dále vybraných izoforem proteinu p73. První studie se zabývá srovnáváním interakcí wt p53 a vybraných „hot spot“ mut p53 s nadšroubovicovou DNA za podmínek změny redoxního stavu zkoumaných proteinů a vlivu vazby specifických monoklonálních protilátek. Metodou horizontální elektroforézy v agarózovém gelu byla analyzována zejména role jednotlivých DNA-vazebných domén testovaných proteinů. Ve druhé studii byla demonstrována upotřebitelnost metody imunoprecipitace komplexů protein-DNA na paramagnetických částicích v kombinaci s následnou elektrochemickou analýzou jako alternativního nástroje ke studiu DNA-vazebných aktivit proteinu p53. K tomu byly využity jednak rozdíly v elektrochemických vlastnostech neznačené nadšroubovicové a lineární plazmidové DNA, díky nimž bylo možno sledovat preferenční vazbu proteinu p53 na jednu z těchto forem v závilosti na různých faktorech (přítomnost specifické sekvence, dostupnost C-terminální DNA-vazebné domény proteinu). Dále byla zavedena metoda využívající oligonukleotidové sondy značené komplexem osmia jako indikátoru vazby p53 k různým neznačeným DNA substrátům, opět v závislosti na různých faktorech ovlivňujících tuto vazbu. Třetí studie byla zaměřena na interakci proteinu p73 s plazmidovými DNA, zejména na srovnání vazebných vlastností izoforem p73α, p73β, p73γ a p73δ, lišících se délkou a složením C-koncové domény. Byl zkoumán vliv iontové síly (koncentrace chloridu draselného) na stabilitu komplexů p73-DNA imunoprecipitovaných na povrchu paramagnetických mikročástic s následnou analýzou DNA pomocí horizontální elekroforézy v agarózovém gelu. Získané výsledky ukazují zejména na nové možnosti analýzy DNA-vazebných vlastností proteinů rodiny p53, které lze s výhodou studovat prostřednictvím imunoprecipitace komplexů protein–DNA na paramagnetických částicích v kombinaci s elektrochemickou analýzou. Vzhledem k rychlosti a vysoké specificitě této techniky lze předpokládat její možné využití též pro studium interakcí i dalších DNA-vazebných proteinů.

Abstract:

In the thesis, results of several thematic studies are presented which have been focused on the investigation of structure-selective DNA interactions of p53 family proteins, namely wild type (wt) p53, different “hot spot” p53 mutants (mut p53) and selected isoforms of the p73 protein. First study is focused on the comparison of interactions of wt p53 and selected mut p53 with supercoiled DNA and on the modulation of these interactions by changes of the p53 redox state and by specific monoclonal antibodies. Using horizontal agarose gel electrophoresis, roles of individual DNA-binding domains of the p53 proteins were analyzed. In the second study we demonstrated usefulness of a technique based on immunoprecipitation of p53-DNA complexes on paramagnetic beads followed by electrochemical analysis as an alternative tool for DNA-protein binding studies. Two approaches were applied. The first is based on the differences in intrinsic electrochemical properties of unlabelled supercoiled and linear plasmid DNA, making it possible to monitor preferential binding of p53 to one of the two DNA forms in dependence on various factors (such as presence or absence of a specific binding sequence, availability of the p53 C-terminal DNA-binding site). The second approach uses an oligonucleotide probe labelled with an electroactive osmium complex as an indicator of p53 binding to different unlabelled DNA substrates (again, in dependence on various factors influencing the binding). The third study was focused on the interaction of p73 protein with plasmid DNAs, especially on the comparison of DNA-binding properties of p73α, p73β, p73γ a p73δ isoforms, differing in the length and composition of their C-terminal domains. The influence of ionic strength (concentration of KCl) on the stability of p73-DNA complexes immunoprecipitated at the magnetic beads surface followed by electrophoresis of dissociated DNA on agarose gel was investigated. The results demonstrate namely new possibilities in the analysis of DNA-binding properties of p53 family proteins which can easily be studied by using immunoprecipitation of the p53-DNA complexes at the magnetic beads in connection with electrochemical analysis. Considering the speed and a high specificity of the latter technique, one can assume its utilization also in studies of DNA binding by other proteins.

Keywords

protein p53, „hot spot“ mutantní proteiny p53, protein p73, selektivní vazba na nadšroubovicovou DNA, elektrochemie, p53 protein, „hot spot“ mutant p53 proteins, p73 protein, supercoil-selective DNA binding, electrochemistry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 2. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 29. 2. 2012
• Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc., RNDr. Roman Hrstka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology