Diverse functions and phase separation properties of RECQ4 helicase N-terminal region

Anna Papageorgiou, MSc

Doctoral thesis

Abstract:

Rapidně rostoucí množství vědeckých prací v současné době poukazuje na to, že celá škála proteinů zapojených do metabolických procesů DNA jsou plně či částečně neuspořádané. Některé tyto vnitřně neuspořádané oblasti (IDR) se mohou skládat do dobře definovaných 3D struktur po vazbě na cílovou molekulu. Jiné naopak zůstávají plně bez terciální struktury a tvoří dynamické komplexy. IDR často představují platformu pro multivalentní interakce se svými partnery (s jinými proteiny či nukleovými kyselinami) a mohou tak napomáhat kapalinové fázové separaci (LLPS). Biomolekulární kondenzace byla pozorována a implikována v celé řadě nukleárních procesů, avšak mechanismy její regulace jsou doposud neznámy. ATP-dependentní DNA helikáza Q4 (RECQ4) je eukaryotickým homologem RecQ rodiny helikáz. Kromě konzervované helikázové domény tato helikáza obsahuje jedinečný N-konec skládající se z homeodomény a neuspořádané, 350 amino kyselin dlouhé, oblasti. Tato převážné neuspořádaná N-koncová oblast obsahuje vazebná místa pro celou řadu struktur DNA, jako jsou například G-kvadruplexy (G4), a také představuje platformu pro mnoho proteinových interakcí. Není tedy překvapivé, že je tato oblast nepostradatelná pro zapojení RECQ4 v replikaci a opravách DNA. Kapitola 1 představuje shrnutí dostupné literatury popisující replikaci DNA, G-kvadruplexy, roli DNA helikáz v replikaci a opravách DNA a specializované funkce RECQ4 helikázy. Dále se tu zabývám základními aspekty vnitřně neuspořádaných proteinů a kapalinovou fázovou separací. V Kapitole 2 popisuji použití NMR a dalších biofysikálních metod na lokalizaci interakce RECQ4 s celou řadou DNA struktur a s Replikačním proteinem A (RPA) do vnitřně neuspořádané oblasti o velikosti 30 reziduí. Tato kladně nabitá IDR tvoří dynamicky neuspořádaný komplex s nukleovými kyselinami, avšak skládá se do uspořádané struktury po vazbě na RPA. Jelikož se tyto dva vazebné módy se navzájem vylučují, je možné, že se toto IDR podílí na regulaci funkce RECQ4 mechanismem předání molekul. Tato oblast se navíc silně váže na mnoho G4 a chrání je tak před aktivitou G4 rozplétajících helikáz. Po překročení prahové koncentrace dojde u IDR a G4 k LLPS. Tito interakční partneři s opačným nábojem vytvoří komplex v roztoku a oddělí tak kondenzovanou fázi dvou-krokovým modelem koacervace. Na základě těchto výsledků lze rozšířit repertoár funkcí IDR a poukázat na novou roly polyelektrolytových komplexů vážících G4. V Kapitole 3 demonstruji interakce RECQ4-homeodomény s 1) různými DNA strukturami, 2) faktorem nukleotidových excizních oprav (NER) Xeroderma Pigmentosum group A (XPA), 3) přilehlými neuspořádanými oblastmi v sekvenci RECQ4. Představuji zde hypotézu, že intramolekulární interakce mohou regulovat afinitu homeodomény pro její interakční partnery. Intermolekulární interakce (homeodoména/XPA, homeodoména/DNA) se vzájemně vylučují. Vazba mezi RECQ4-homeodoménou a XPA je přerušena kompeticí s Excision Repair Cross Complementation group 1 (ERCC1) proteinem. Naše poznatky, spolu s literaturou demonstrující stimulaci interakce a ko-lokalizace RECQ4 s XPA po vystavení buňky UV záření, naznačují, že se RECQ4 podílí na opravách poškození DNA indukovaných UV zářením. Poznatky této práce poukazují na nevídanou mechanistickou plasticitu a funkční víceúčelovost RECQ4, která může sloužit jako základ pro budoucí in vitro a in vivo studie cílící na odhalení molekulárních mechanismů funkce RECQ4 v nejrůznějších procesech metabolismu.

Abstract:

Recently, a rapidly expanding body of work has recognized that many proteins involved in DNA metabolic processes are fully or partially unstructured. Some of these intrinsically disordered regions (IDRs) can adopt well-defined 3D structures upon binding to their targets, while others remain completely unstructured forming dynamic complexes. Interestingly, IDRs can mediate multivalent interactions with their partners (other proteins or nucleic acids) and thus often drive liquid-liquid phase separation (LLPS). Biomolecular condensates have been observed and implicated in a variety of nuclear processes, but it is unknown how these are mediated and regulated. ATP-dependent DNA helicase Q4 (RECQ4) is a eukaryotic homologue of the ubiquitous RecQ helicase family. Other than the conserved helicase domain, it contains a unique N-terminal region consisting of a homeodomain and a disordered stretch of about 350 amino acids. The largely disordered RECQ4 region contains multiple DNA binding sites recognizing a variety of DNA structures, including among others G-quadruplexes (G4s). It also acts as a platform for many protein interacting partners, thus being essential for RECQ4 distinct functions in DNA replication and repair. In Chapter 1, I give a literature overview on DNA replication, G-quadruplexes, the function of DNA helicases in DNA replication and repair, and the specialized functions assigned to RECQ4 helicase. Then, I cover the basic aspects of intrinsically disordered regions and liquid-liquid phase separation. In Chapter 2, I used NMR and various biophysical methods to localize the interactions between RECQ4, various DNA structures and Replication protein A (RPA) to an intrinsically disordered region (IDR), spanning 30 residues in total. The positively charged IDR forms a dynamic disordered complex with nucleic acids but folds upon binding to RPA. The two binding modes are mutually exclusive, suggesting a regulatory role for the IDR in RECQ4 function by enabling molecular handoffs. Moreover, the IDR binds strongly to various G4 structures and protects them from the activity of G4 unwinding helicases. Beyond a concentration threshold, IDR and G4 undergo LLPS. The oppositely charged IDR and G4 molecules form a complex in solution that partitions to the condensed phase, described by a two-step model of coacervation. These findings extend the functional repertoire of IDRs and demonstrate a novel role of polyelectrolyte complexes involved in G4 binding. In Chapter 3, I demonstrate that RECQ4-homeodomain interacts with 1) various DNA structures, 2) the nucleotide excision repair (NER) factor Xeroderma Pigmentosum group A (XPA), 3) the adjacent disordered region in RECQ4 sequence. I hypothesise that the intramolecular interaction might regulate the affinity of homeodomain with its partners. The intermolecular interactions (homeodomain/DNA, homeodomain/XPA) are mutually exclusive. The RECQ4-homeodomain is outcompeted for XPA binding by the Excision Repair Cross Complementation group 1 (ERCC1) protein. Our findings along with a report in the literature that UV treatment stimulates RECQ4 interaction and colocalization in nuclear foci with XPA, implies a RECQ4 role in the repair of UV-induced DNA damage in the cell. Taken together, the findings presented in this work highlight an unprecedented mechanistic plasticity and functional versatility of RECQ4 that can serve as a foundation for future in vitro and in vivo studies, aiming to uncover the molecular mechanism of function of full-length RECQ4 in various DNA metabolic processes.

Keywords

RECQ4 helikázy, G-kvadruplexy, fázová separace, vnitřně neuspořádaná oblast, přechod neuspořádané-uspořádané, nukleární magnetická rezonance, RECQ4 helicase, G-quadruplex, phase separation, intrinsically disordered region, disorder-to-order transition, nuclear magnetic resonance

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 2. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 20. 3. 2023
• Supervisor: Ph.D. Konstantinos Tripsianes
• Reader: Prof. RNDr. Jiří Vondrášek, Ph.D., Prof. Dr. Remco Sprangers, Prof. Georgios A. Spyroulias

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Life Sciences / Life Sciences