Proteomická analýza antimikrobiálních účinků terpenů pomocí MALDI-TOF

Bc. Linda Nezbedová

Master's thesis

MALDI-TOF proteomic analysis of antimicrobial effect of terpenes

Anotácia:

Antimikrobiální aktivita složek silic, je známa od pradávna, mechanismus jejich antibakteriálního účinku byl však objasněn teprve nedávno; tyto látky způsobují rozsáhlé změny na buněčné membráně: ovlivňují propustnost membrány, porušují lipidovou dvojvrstvu a podmiňují změny v syntéze proteinů. Právě syntéza proteinů způsobená stresem podmíněným antibakteriální látkou je neprozkoumanou oblastí a dosud bylo publikováno jen několik studií zabývajících se touto problematikou. Tato diplomová práce se zabývá identifikací nízkomolekulárních proteinů vytvořených po ošetření buněk E. coli K-12 různými složkami silic, převážně terpeny. Pro všechny složky silic byla nejprve mikrodiluční metodou stanovena minimální inhibiční koncentrace. Ze všech 42 testovaných složek silic významnou antibakteriální aktivitu prokazovalo pouze 12 složek v různých MIC pohybujících se v rozmezí od 256 mg/L do 2048 mg/L. Tyto složky silic spolu s antibiotikem tetracyklin, peroxidem vodíku a chlornanem sodným, byly následně použity k ošetření buněk E.coli pro analýzu stresové reakce. Pro samotnou analýzu proteinů byla využita metoda MALDI-TOF, což je efektivní a rychlá metoda, která v proteomické analýze představuje metodu první volby. Velké množství získaných dat bylo poté statisticky vyhodnoceno analýzou hlavních komponent.Výsledky experimentu potvrdily vliv terpenů a ostatních složek silic na tvorbu nízkomolekulárních proteinů E. coli K-12. Z 297 naměřených m/z jsme identifikovali 94 různých proteinů s odlišnými vlastnostmi a funkcemi. Mezi identifikovanými proteiny byly ribozomální proteiny; membránové proteiny; stresové proteiny; proteiny, které ovlivňují rezistenci bakteriálních buněk vůči antibiotikům; ale také proteiny podílející se na tvorbě biofilmu. Dále byla zjištěna významná podobnost mezi složkami silic navzájem (např. karvakrolu, karvonu a karvomentenolu nebo citronellolu a citralu), a mezi některými složkami silic a komerčně užívanými antibakteriálními látkami, konkrétně guajakolu a tetracyklinu. Této synergie by mohlo být využito v boji proti rezistenci bakteriálních buněk vůči antibiotikům a dezinfekčním prostředkům. Získané poznatky mohou posloužit dalšímu výzkumu.

Abstract:

Antimicrobial activity of essential oils components has been known for many years, but the mode of their antibacterial action has been clarified recently; these substances cause many changes in the cell membrane structure: affect membrane permeability, break lipid bilayer and affect changes in protein synthesis. Only few studies have been published in the area of the protein synthesis induced by stress after cell treatment with antibacterial agent.The aim of this study was to identify low molecular weight proteins synthesized after treatment of E. coli K-12 cells with various components of essential oils, mainly terpenes. By using microdilution method was first determined a minimum inhibitory concentration for all tested components. From 42 tested essential oils components only 12 components showed significant antibacterial activity in different MIC ranging from 256 mg/L to 2048 mg/L. This components plus antibiotic tetracycline, hydrogen peroxide and sodium hypochloride, were used for E. coli cells treatment in stress response analysis. For the analysis of proteins, the MALDI-TOF was used, this method is efficient and fast and represents a first choice method in proteomics. The large amount of obtained data was statistically evaluated by principal component analysis.In the experiment we proved the effect of terpenes and other essential oils components on the low molecular weight proteins production by E. coli K-12. From 297 measured m/z we were able to identify 94 different proteins with different properties and functions. Identified proteins include ribosomal proteins; membrane proteins; stress proteins; proteins that affect the resistance of bacterial cells to antibiotics; also proteins involved in biofilm formation. Furthermore we have found significant synergy in protein profiles for some essential oils components (carvacrol, carene and carvomenthenol or citral and citronellol) and synergy of some essential oils components with commercially used antibacterial agents, particularly guaiacol and tetracycline This synergy could be used to combat the resistance of bacterial cells to antibiotics and disinfectants. The obtained results can help in further research.

Kľúčové slová

proteomika, proteiny, silice, terpeny, antibakteriální, MALDI-TOF

Keywords

proteins, essential oils, terpenes, antibacterial, MALDI-TOF, proteomics

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: doc. Ing. Pavel Klouček, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / odbor:
Nutrition and Foodstuffs / Nutrition and Foodstuffs