In vivo analýza dynamiky telomer v buňkách s různými mechanismy prodlužování telomer

Bc. Anna Ogrocká, Ph.D.

Diplomová práce

In vivo analysis of telomere dynamics in cells with different telomere length maintenance mechanisms

Anotace:

Cílem této práce bylo srovnat rychlost pohybu telomer během buněčného cyklu a u tří buněčných linií s různými mechanismy prodlužování telomer. Telomery jsou úseky repetitivní DNA na koncích chromozomů. Chrání konce chromozomů před tím, aby byly chybně rozpoznány jako dvouřetězcové zlomy DNA. V normálních lidských buňkách se délka telomer s každým buněčným cyklem zkracuje. Tento proces limituje počet možných buněčných dělení a působí jako účinný inhibitor tvorby nádorů. Většina nádorů unikne tomuto omezení počtu možných dělení tím, že aktivuje některý z mechanismů údržby délky telomer – telomerázu nebo ALT mechanismus. Studovali jsme dynamiku telomer in vivo v lidských buňkách za použití fluorescenční mikroskopie. Telomery byly značeny fluorescenčními proteiny GFP a EYFP fúzovanými s telomer vazebnými proteiny TRF1 a TRF2. Zkoumali jsme tři různé buněčné populace: U-2 OS (rakovinné, ALT+), HeLa (rakovinné, telomeráza+) and IMR-90 (zdravé, bez mechanismu údržby délky telomer). Synchronizaci buněčného cyklu jsme prováděli metodou dvojitého tymidinového bloku. Jako kontrola fáze buněčného cyklu sloužila kvantifikace buněčné frakce na průtokovém cytometru. Buňky byly snímány v režimech 3D a fast 2D, HeLa buňky navíc i v režimu superfast 2D. Snímání v režimu 3D neodhalilo významné rozdíly v rychlosti pohybu telomer. Telomery buněk HeLa více než telomery ostatních buněčných linií pohybují v ose XY a méně v ose Z. Naměřená rychlost telomer se pohybuje kolem 0,14 mikrometr za minutu. Při snímání v režimu fast 2D se objevily se první rozdíly v rychlosti pohybu telomer mezi jednotlivými fázemi buněčného cyklu a telomery buněk HeLa byly dvakrát rychlejší než telomery zbylých buněčných linií. Průměrná rychlost telomer HeLa buněk byla v S fázi 0,31 mikrometr/s a průměrná rychlost linií U-2 OS a IMR-90 byla v téže fázi 0,14 mikrometr/s. Telomery měly velmi nízkou směrovost, tzn. pravděpodobně kmitají v omezeném rozsahu a nikam nesměřují. Se zkracujícím se intervalem snímání se objevují rozdíly v rychlostech telomer mezi buněčnými liniemi a jednotlivými fázemi buněčného cyklu. Telomery HeLa buněk byly ve fázi G1 snímány v režimu superfast 2D. Jejich průměrná rychlost byla 1,42 mikrometr/s. Je pravděpodobné, že jsou telomery ve skutečnosti ještě rychlejší. Ze snímání v režimu superfast 2D vyplývá, že je třeba výsledky ze snímání v režimu 3D a fast 2D hodnotit velmi opatrně.

Abstract:

The aim of this work was to evaluate speed of telomere movement during cell cycle and in three cell lines with different telomere length maintenance mechanisms. Telomeres are tracts of repetitive DNA at each chromosome end. Telomeres prevent the natural end of the chromosome from being recognized as a double-stranded DNA break. In normal human cells, the telomere length decreases per each cell cycle. This telomere shortening process ultimately limits the number of times a cell can divide, and acts as a powerful tumor suppressor mechanism. The great majority of cancers escape from the limitations on proliferation imposed by normal telomere shortening via activation of a telomere length maintenance mechanism – telomerase or alternative lengthening of telomeres (ALT). Using fluorescent proteins GFP and EYFP fused with telomere binding proteins TRF1 and TRF2 we studied the dynamic of telomeres in vivo in human cells. We studied three different cell populations: U-2 OS (cancer cells, ALT+), HeLa (cancer cells, telomerase+) and IMR-90 (healthy, without a telomere length maintenance mechanism). Synchronous populations of U-2 OS, HeLa, IMR-90 cells were obtained by double thymidine block. As a control cell cycle fractions were quantified through fluorescent-activated cell sorted analysis.. Telomere dynamics were imaged from minutes to several hours during cell cycle using fluorescence microscopy. Data were acquired from selected cells from each phase of cell cycle. Cells were scanned in 3D and fast 2D modes. HeLa cells were scanned also in superfast 2D mode. Scanning in mode 3D did not show significant differences of telomere speed between particular cell lines or particular phase of cell cycle. Telomeres of HeLa cells move in XY axes more and in Z axis less than telomers of the another cell lines. Measured speed of telomere movement was about 0,14 micrometr per minute. Scanning in mode fast 2D showed first differences between speed of telomere movement during cell cycle and among different cell lines. Telomeres of HeLa cells were twice faster then telomeres of other cell lines. In S phase of cell cycle, average speed of telomeres of HeLa cells was 0,31 micrometr/s and average speed of telomeres of U-2 OS and IMR-90 cells was 0,14 micrometr/s. Telomeres had very low directivity, telomeres probably do constrained diffusive movement and do not show significant directional movements. Differences in telomere speed (between cell lines and between phases of cell cycle) are coming out with shortening time interval of scanning. Telomeres of HeLa cells were scanned in phase G1 of cell cycle in mode superfast 2D. Their average speed was 1,418 micrometr/s. In fact, telomeres are probably even faster. It results from scanning in mode superfast 2D, that the results from scanning in modes 3D and fast 2D should be assessed very carefully.

Klíčová slova

dynamika telomer, rychlost telomer, fluorescenční mikroskopie, telomeráza, ALT mechanismus, U2-OS, HeLa, IMR-90, dvojitý tymidinový bloktelomere dynamics, telomere speed, telomerase, ALT, double thymidine block, fluorescent microscopy

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 18. 5. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 6. 2009
• Vedoucí: Mgr. Ing. Jana Amrichová, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Petra Procházková Schrumpfová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika