Využití gun bombardment pro inokulaci rostlin viry jako nástroj ve studiu RNA interference

Ludmila BRTIŠOVÁ

Bachelor's thesis

Using of the gun bombardment in inoculation of plants by plant viruses as a tool in the study of RNA interference

Abstract:

RNA interference (RNAi) je mechanismus regulující genovou expresi prostřednictvím dvouvláknové RNA (dsRNA). Tento proces probíhá díky krátkým jednovláknovým fragmentům produkovaným z dsRNA prostřednictvím asociace dsRNA s enzymatickými komplexy, které jsou pak schopny rozpoznat příslušnou mRNA a následně ji degradovat. Ačkoliv je RNAi studována především na modelových organismech, jako je hlístice C. elegans, Drosophila melanogaster nebo Arabidopsis thaliana, vyskytuje se přirozeně i u ostatních rostlin, hub, nižších a vyšších živočichů. Zásadní roli v RNAi hrají malé RNA molekuly. Tyto RNA mohou být exogenního či endogenního původu, a v tomto smyslu jsou rozlišovány dvě základní dráhy RNAi. První, exogenní dráha, je aktivována přítomností siRNA, jejíž antisense vlákno je začleněno do RISC komplexu, což vede ke štěpení komplementární mRNA. Druhou možností RNAi je endogenní dráha. Tady dochází ke vzniku miRNA z vlásenkového prekurzoru. Vedoucí vlákno miRNA je zapojeno do RISC komplexu, který je opět schopen rozeznat cílovou mRNA a štěpením ji degradovat. V rámci experimentální části jsem se snažila ověřit, zda je možné, a případně s jakou efektivitou, infikovat rostliny hrachu setého (Pisum sativum L.) virem semenem přenosné mozaiky hrachu (PSbMV) metodou gun bombardmentu. U experimentálních rostlin byly aplikovány varianty inokula s různými vlastnostmi. Úspěšnost jednotlivých variant byla hodnocena nejprve na základě vizuálně pozorovaných symptomů, dále pak metodou DAS-ELISA a poté u vybraných vzorků pomocí RT-PCR. Gun bombardment může vést k úspěšné inokulaci rostlin hrachu, tzn., že je možné touto metodou navodit virovou infekci. Podmínky, za kterých bylo dosaženo nejefektivnější aplikace inokula, byly následující: aplikace inokula ředěného v poměru 1:2 (listy z infekční rostliny : fosfátový pufr), použití karborunda (1% w/v) pro porušení povrchu listu a aplikace dvojnásobné infekční dávky (dva výstřely do jednoho listu, tzn. 2x20?l). Za dodržení těchto podmínek bylo 60% sledovaných rostlin hrachu úspěšně infikováno virem semenem přenosné mozaiky hrachu.

Abstract:

RNA interference (RNAi) is a mechanism regulating gene expression through double-stranded RNA (dsRNA). This process is processed through short single-stranded fragments produced from the dsRNA via its association with enzymatic complexes that are able to recognize the corresponding mRNA and degrade it subsequently. Although RNAi is studied mainly in model organisms such as nematode C. elegans, Drosophila melanogaster and Arabidopsis thaliana it is known that occurs naturally also in other plants, fungi, lower and higher animals. Small RNA molecules play the fundamental role in RNAi. They have exogenous or endogenous origin and in that sense can be distinguish two main pathways of RNAi. The first one, exogenous pathway, is activated by the presence of siRNA whose antisense strand is incorporated into the RISC complex. It leads to complementary mRNA cleavage. The second way of RNAi is endogenous pathway. For this pathway is typical formation of miRNA from stem-loop precursor. Leading strand of miRNA is recruited to RISC complex which is able again to recognize the target mRNA and degrade by cleavage. In the experimental part of this bachelor thesis I was verifying possibility and the effectiveness of the gun bombardment in succesfull infection of pea plants (Pisum sativum L.) by Pea seed borne mosaic virus (PSbMV). Various types of inoculum were applied to experimental plants and positive detection was first evaluated by visually observed symptoms followed by DAS-ELISA and subsequently by RT-PCR in selected samples. The gun bonbardment can lead to succesfull inoculation of pea plants by the virus as well as their experimental infection. The most effective parameters of application were: inoculum dilution in the ratio 1:2 (leaves from source infected plants : phosphate buffer), using of carborundum (1% w/v) for leaf surface abrasion and application of double infectious dose (two shots into one leaf, it means 2x20?l). Under these conditions 60% of experimental pea plants were succesfully infected by the Pea seed borne mosaic virus.

Keywords

RNA interference, miRNA, siRNA, posttranskripční umlčování genů, transkripční umlčování genů, viry indukované umlčování genů, gun bombardment, DAS-ELISA, RT-PCR, qRT-PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 4. 2012

Accessible from:: 17. 4. 2012

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Dana Šafářová, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology