Separace a prekoncentrace peptidů a proteinů elektroforetickými metodami (Isoelektrická fokusace bez nosiče, =CAFIEF, dvourozměrná CE, frakcionace)

Mgr. Jana Budilová, Ph.D.

Doctoral thesis

Separation and concentration peptides and proteins by electrophoretical methods (Carrier ampholyte free - isoelectric focusing, two dimensional capillary electrophoresis, fractionation)

Abstract:

Hmotnostní spektrometrie se stále více využívá při analýze složených proteomických vzorků. Před vlastním MS měřením je často nutné vzorek preparovat kvůli odstranění rušivých vlivů matrice a k zakoncentrování analytů. K těmto účelům lze využít metodu CAF-IEF. V této práci byla metoda CAF-IEF provedena na komerčně dodávaném přístroji EA 101 (Villa Labeco, Slovensko), který byl vybaven speciálně vyrobenou kolonou pro dávkování větších objemů vzorků (až do 0,5 ml). K CAF-IEF byl navrhnut nový kontinuální mód, který nevyžaduje výměnu elektrolytu s přerušením průchodu proudu. V tomto módu byla provedena fokusace nízkomolekulárního pI markeru (PIM 7,4) a roztoku 0,016 mg/ml myoglobinu nebo inzulínu, po té byly odebrány 5 µl frakce k off-line analýze. Celkový čas fokusace byl 66 minut. Koncentraci PIMu 7,4 ve frakci se podařilo zvýšit až 75 krát (stanoveno pomocí UV VIS spectrometru). Koncentrace myoglobinu ve frakci se zvýšila až 33 krát a inzulínu 10 krát. Kvalitativní identifikace proteinu ve frakci byla provedena MALDI TOF-MS a ke kvantifikaci se použila CZE. Po té byla testována semipreparace a zakoncentrování směsi proteinů (cytochromu C, myoglobinu a inzulínu) s dávkovanou koncentrací přibližně 0,03 mg/ml jednotlivých proteinů a objemem 0,5 ml. V některých odebraných frakcí byla zvýšena koncentrace myoglobinu 46 krát, cytochromu C 45 krát a inzulínu 4 krát. Tato práce ukázala, že lze na přístroji EA 101 provést semipreparaci se zakoncentrováním proteinů metodou CAF-IEF s využitím komerčního frakcionačního kohoutu. Potenciál metody CAF-IEF k využití této metody pro zakoncentrování a semipreparaci je, že získané frakce reálného vzorku by neměli obsahovat složitou matrici, která obvykle ruší další analýzy.

Abstract:

Mass spectrometry is being increasingly used for analysis of proteome complex samples. Sample preparation is often necessary to remove matrix interferences and to concentrate analytes prior to MS measurement. A useful method for this purpose is Carrier Ampholyte Free-Isoelectric Focusing (CAF-IEF). In this work CAF-IEF of ampholytes was performed on a commercial apparatus EA101 (Villa Labeco, Slovakia) equipped with a specially made column for samples of large volume (up to 0.5 mL). A new continuous mode without voltage interruption or electrolyte replacement was developed. In this mode, a low molecular mass pI marker (PIM 7.4) and low concentrations of myoglobin and insulin (0,016 mg/mL), respectively, were concentrated, and then 5-ul fractions collected for off-line analyses. The total time of focusing was 66 minutes. The concentration of PIM 7.4 in the fractions was increased up to 75 times (determined by UV-VIS spectrometry). The concentration in the fractions was increased up to 30 times for myoglobin and 10 times for insulin. Qualitative identification of protein´s fractions was performed on MALDI TOF MS and for Quantification was used CZE. After that semipreparation and also pre-concentration of mixture proteins (cytochrome C, myoglobin and insulin) with dosing concentration of cca 0,03 mg/ml and volume 0,5 ml was tested. In collected fractions there was an increase in concentration of cca 46 times for myoglobin, 45 times for cytochrome C and 4 times for insulin. This work demonstrated that it is possible to achieve semipreparation with pre-concentration of proteins by CAF-IEF method with utilization of commercial fractionation valve. The advantage of CAF IEF with regards to a use for preconcentration and semipreparation is, that collected fractions of real sample should not contain complicated matrix, which usually interferes with other analysis‘. Separace a prekoncentrace peptidů a proteinů elektroforetickými metodami (Izoelektrická fokusace bez nosiče, =CAF-IEF, dvourozměrná CE, frakcionace)

Keywords

elektroforetické metody, kapilární zónová elektroforéza, kapilární izotachoforéza, kapilární izoelektrická fokusace, fokusace bez nosných amfolytů, semipreparace, prekoncentrace, dávkování větších objemů vzorků, proteiny, myoglobin, inzulín, cytochrom C, frakcionace, výtěžnost, hmotnostní spektrometrie MALDI–TOF MS. electrophoretic method, capillary zone electrophoresis, capillary isotachophoresis, capillary isoelectric focusing, carrier ampholyte free – isoelectric focusing, semipreparation, preconcentration, large volume dosing, proteins, insulin, cytochrome C, fractionation, recovery, mass spectrometry, MALDI–TOF MS

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 6. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 19. 9. 2011
• Supervisor: doc. RNDr. Jiří Pazourek, Ph.D.
• Reader: prof. Juraj Ševčík, Ph.D., doc. RNDr. Karel Šlais, DrSc., prof. RNDr. Hana Dočekalová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Analytical Chemistry