Vnímavost kaprovitých a nekaprovitých druhů ryb k CyHV-3

Mgr. Aleš POSPÍCHAL

Doctoral thesis

Susceptibility of cyprinid and non-cyprinid species to CyHV-3

Abstract:

"Kapří herpesvirus 3" - Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) známý také jako koi herpesvirus (KHV) je původcem vysoce nakažlivé choroby (koi herpesviróza) a může způsobit v populacích ryb značné ztráty. Tato choroba je v přirozených podmínkách hostitelsky omezena na barevné variety kapra - koi a kapry obecné. Nedávná šetření však ukázala, že i jiné kaprovité a nekaprovité druhy mohou být vůči tomuto viru asymptomaticky vnímavé a mohly by hrát roli potenciálních nosičů nebo mohou přispět k "biologickému zakonzervování" viru vedoucímu k jeho přetrvávání v prostředí. Proto se jeví jako důležité ověřit nejen citlivost jiných kaprovitých a nekaprovitých druhů ryb, ale také jejich schopnost přenášet infekci CyHV-3 na vnímavé druhy. Z výše zmíněných důvodů jsme tedy testovali vnímavost mřenky mramorované (Barbatula barbatula) a sterbela - hybrida mezi jeseterem malým (Acipenser ruthenus) a vyzou velkou (Huso huso) vůči koi herpesviru. Experimentální infekce byla provedena metodou kohabitace - sdílení stejného vodního prostředí spolu s naivními koi kapry a koi kapry intraperitoneálně infikovanými KHV - primární část pokusu). Po této části experimentu následovala sekundární část pokusu, kdy část přeživších mřenek mramorovaných a sterbelů byla kohabitována se zdravými naivními koi (testování schopnosti přenášet KHV). Všechny vzorky ryb jak z primární části, tak ze sekundární části byly testovány na přítomnost KHV DNA pomocí nested PCR. Výsledky PCR z primární infekce ukázaly přítomnost KHV DNA v 95% vzorků odebraných z kohabitovaných koi, dale pak v 77.8% (7/9) vzorků mřenky mramorované a ve 22.2% (2/9) v případě sterbela. Ve vzorcích pocházejících ze sekundárního testu nested PCR neprokázala KHV DNA ani v jednom případě naivních koi kohabitovaných s mřenkami a sterbely z primární infekce. Náš další výzkum byl zaměřen na hodnocení vnímavosti střevličky východní (Pseudorasbora parva). I zde byla k experimentální infekci použita metoda kohabitace. V prvním experimentu, kde jsme kohabitovali střevličku s infikovanými koi za standardních podmínek, nested PCR neodhalila přítomnost KHV DNA ve tkáních tohoto testovaného druhu. V dalším experimentu jsme změnili experimentální podmínky a aplikovali jsme dva stresové faktory (plašení sítí a odstranění kožního hlenu), abychom napodobili stresové situace, které se mohou vyskytovat ve volné přírodě. Všechny experimenty se skládaly z primárních a sekundárních částí, stejně jako ve všech předchozích případech testování. Všechny ryby (mrtvé, přeživší a usmrcené) byly testovány na přítomnost KHV DNA pomocí konvenční nested PCR (experiment bez stresu) a real-time PCR (stresový experiment). Po primární části pokusu bez stresu nested PCR neodhalila přítomnost KHV DNA v žádném vzorku z kohabitovaných střevliček, ale všechny vzorky z uhynulých koi nested PCR pozitivní byly. Výsledky nested PCR rybích tkání ze sekundární části pokusu neprokázaly přenos viru na naivní ryby. Po vystavení střevličky východní stresu (odstranění kožního hlenu) kvantitativní PCR odhalila čtyři z pěti vzorků (80%) pozitivní na přítomnost KHV DNA. Dále bylo zjištěno, že dva z pěti vzorků (40%) plašených střevliček východních jsou pozitivní na přítomnost virové DNA. Kvantitativní PCR po sekundární expozici však neodhalila žádnou virovou DNA ve vzorcích střevliček dříve vystavených stresu. Stresové experimenty naznačují, že odstranění kožního hlenu by mohlo potenciálně vést k vyšší náchylnosti střevličky východní k infekci koi herpesvirem, nicméně přenos viru na koi kapra nebyl pozorován. Přestože PCR pozitivní nálezy KHV DNA v tkáních ryb byly relativně nízké, předložené výsledky kohabitačn

Abstract:

Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) also known as koi herpesvirus (KHV) is a causative agent of highly contagious disease (koi herpesvirus disease) and can cause significant losses in fish stocks. The disease is restricted to koi and common carp, but recent investigations have shown that other cyprinids as well as non-cyprinid species may be asymptomatically susceptible to this virus and might play roles as potential carriers or can contribute to biological conservation leading to persistence of this virus in environment. Therefore, it seems to be important to verify not only the susceptibility of other cyprinid and non-cyprinid species, but also their ability to transmit KHV infection to susceptible species. We investigated the susceptibility of stone loach (Barbatula barbatula) and sterbel - a hybrid between sterlet (Acipenser ruthenus) and beluga (Huso huso) to KHV. The investigation was performed by means of their cohabitation together with na?ve koi and intraperitoneally KHV-infected koi (primary challenge). This part of investigation is followed by secondary challenge, when a portion of the surviving stone loach and sterbel was cohabited with health na?ve koi (testing of ability to carry KHV). All samples of fish both from primary challenge and secondary challenge were tested for the presence of KHV DNA by nested PCR. In the primary challenge, results of PCR revealed the presence of KHV DNA in 95% of cohabited na?ve koi samples. Furthermore, PCR analysis of fish samples surviving primary challenge revealed the presence of viral DNA in 77.8% (7/9) of stone loach and in 22.2% (2/9) of sterbel. In case of samples of fish coming from secondary challenge, nested PCR did not reveal any of them to be positive for KHV DNA. Next investigation was focused on assessment of the susceptibility of topmouth gudgeon (Pseudorasbora parva). In this case, we performed cohabitation based on two different conditions. All experiments consisted of primary and secondary challenges as well as in all previous cases. Firstly, we tested topmouth gudgeon under standard conditions (no-stress experiment). After the primary challenge, nested PCR did not reveal the presence of KHV DNA in any specimen of cohabited topmouth gudgeon, but all specimens of dead koi were KHV DNA positive. Nested PCR of fish tissues subjected to the secondary challenge did not show the transfer of virus to naive fish. After that, we changed the experimental conditions and we applied two stress factors (scaring by net and removal of skin mucus) to imitate the stress most commonly encountered in the wild. In this case, all samples were tested for the presence of KHV DNA using real-time PCR. After exposure to stress (removal of skin mucus), real-time PCR revealed four out of five samples (80%) of topmouth gudgeon to be positive for KHV DNA. Two out of five samples (40%) of topmouth gudgeon treated by scaring were found to be positive for the presence of viral DNA. Real-time PCR after the secondary challenge did not reveal any viral DNA positivity in specimens of topmouth gudgeon from groups previously exposed to stress. The stress experiments showed that removal of skin mucus might potentially lead to susceptibility of topmouth gudgeon to CyHV-3 infection, but the transmission of the virus to koi carp was not observed. Even though PCRs positive findings of KHV DNA in tissues of fish were relatively low, the presented results of cohabitation assays of cyprinid and non-cyprinid fish species indicate other species showing slight asymptomatic susceptibility to CyHV-3. On the other hand, on the base of our results coming from "virus-carrier" assays, we could not prove that hybrids between sterlet and beluga, stone loach and topmouth gudgeon can transfer this virus to naive koi.

Abstract:

ích testů kaprovitých a nekaprovitých druhů ryb naznačují, že i jiné druhy ryb vykazují mírnou asymptomatickou vnímavost vůči CyHV-3. Na druhou stranu, na základě našich výsledků se nám nepodařilo u hybridů jesetera malého a vyzy velké, mřenky mramorované ani střevličky východní prokázat vironosičství.

Keywords

koi herpesvirus, cyprinid herpesvirus-3, vnímavost, kohabitace, jeseter malý, vyza velká, střevlička východní

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 9. 2019

Thesis defence

• Supervisor: MVDr. Veronika Piačková, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery