Vývoj nových molekulárně biologických metod detekce putrescin produkujících bakterií

Mgr. Leona WUNDERLICHOVÁ

Doctoral thesis

Development of new molecular biological methods for the detection of putrescine producing bacteria

Abstract:

Předložená dizertační práce se zabývá vývojem nových molekulárně biologických metod detekce putrescin produkujících technologicky relevantních mikroorganizmů. Zabývá se možnostmi detekce mikrobiálních producentů putrescinu metodami molekulární biologie, zejména pak vývojem polymerázové řetězové reakce (PCR) určené k detekci těchto producentů. Putrescin může být u bakterií tvořen několika metabolickými drahami, v nichž je zahrnuta řada enzymů. Prozatím nebyla publikována žádná metoda pro detekci všech metabolických drah produkce putrescinu amplifikací odpovídajících genů pomocí PCR. V dizertační práci je popsán postup vytvoření takovéto molekulárně biologické metody - tedy metoda umožňující detekci klíčových genů zahrnutých v bakteriální produkci putrescinu. Byla vytvořena spolehlivá PCR metoda pro detekci a výzkum metabolizmu putrescinu u gramnegativních i grampozitivních bakterií. Výsledkem je vytvoření sedmi nových sad PCR primerů, které jsou určeny k detekci cílových genů. Tyto primery byly úspěšně testovány s 32 kmeny gramnegativních producentů putrescinu. Pro potřeby detekce a výzkumu metabolizmu putrescinu u grampozitivních kmenů, byla úspěšně testována a aplikována sada primerů publikovaná v předchozích výzkumech. Byla vytvořena a optimalizována PCR metoda s použitím těchto primerů. Jak sekvenační analýza, tak i výsledky HPLC potvrdily specifičnost navržené metody a nově navržených primerů. Nové primery byly navíc také úspěšně testovány pro použití v jiných variantách PCR, jako je například multiplex PCR nebo PCR s předchozí reverzní transkripcí.

Abstract:

This doctoral thesis deals with the development of new molecular biological methods for the detection of putrescine producing technologically relevant microorganisms. It deals with the possibility of detection of microbial producers of putrescine by methods of molecular biology, in particular the development of new methods of polymerase chain reaction (PCR) for the detection of these producers. Putrescine can be formed by microbial metabolism via several metabolic pathways in which a number of enzymes is included. There have been presented no method for the detection of metabolic pathways of production putrescine by amplification of the corresponding genes using PCR yet. The dissertation describes development of such a molecular biological method - i.e. method that allows the detection of key genes involved in bacterial production of putrescine. It was created a reliable PCR method for the detection and investigation of putrescine metabolism in gram-negative and gram positive-bacteria. The result is the creation of seven new sets of PCR primers which are designed to detect target genes .The result of this work is the creation of seven new sets of PCR primers which are designed to detect target genes. These primers have been successfully tested in PCR with 32 strains of gram-negative producers of putrescine. For the purpose of detection and research in putrescine metabolism in gram-positive strains were successfully tested sets of primers published in previous research. It was optimized PCR method in applying those primers. Sequence analysis as well as the HPLC results confirmed the specificity of the proposed methods and newly designed primers. New primers were also successfully tested for the use in other variations of PCR, such as multiplex PCR or PCR prior to reverse transcription.

Keywords

PCR, primer, biogenní aminy, putrescin, touch-down PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 2. 2014

Accessible from:: 25. 2. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 2. 4. 2014

Tomas Bata University in Zlín

Faculty of Technology

Doctoral programme / field:
Chemistry and Materials Technology / Chemistry and Materials Technology