Identification and Validation of Dvl interacting partners using Proteomics approach

Sri Ranjani Ganji, M.Sc.

Doctoral thesis

Abstract:

Signální dráhy Wnt jsou vysoce konzervované signální kaskády, které regulují základní procesy embryonálního vývoje a homeostázy dospělého organismu. Všechny známé Wnt ligandy přenášejí signál přes receptor Frizzled (Fzd) a cytoplasmatický fosfoprotein Dishevelled (Dvl). Wnt dráhy se dělí na Wnt/β-kateninovou a nekanonické Wnt dráhy. Mechanismy kontrolující různé Wnt dráhy nejsou zcela objasněny, ale předpokládá se, že Dvl je jedním z hlavních kontrolních bodů. Dvl je molekulární scaffold, umožňující interakci aktivátorových a efektorových proteinů v jednotlivých drahách. Aktivita Dvl je kontrolována různými posttranslačními modifikacemi jako jsou ubiquitinace a fosforylace. Navzdory dobře zdokumentované důležitosti Dvl pro signální dráhy Wnt je molekulární mechanismus přenosu signálu, jímž je Dvl aktivován v jednotlivých Wnt drahách, neznámý. Abychom pochopili endogenní funkce Dvl, použili jsme nezávislé analýzy aktivity a složení komplexů proteinů vázajících se na Dvl. Využili jsme imunoprecipitace endogenního Dvl spojené s hmotnostně spektrometrickou (IP-MS) analýzou jako hlavního nástroje této studie. Identifikovali jsme mnoho známých a také nových interakčních partnerů Dvl. Funkčně jsme ověřili tři nové proteiny vázající Dvl. (i) Tiam1, Rac1 GEF. Dokázali jsme, že Tiam1 kontroluje Wnt-Dvl řízenou aktivaci Rac1 v nekanonických Wnt drahách, a že Tiam1 je také nezbytný pro nekanonické Wnt dráhy zodpovědné za diferenciaci dopaminergních neuronů. (ii) Huwe1, E3 ligáza. Identifikovali jsme Huwe1 jako další z nových interakčních partnerů Dvl a dokázali jsme, že Huwe1 kontrolovaná ubiquitinace Dvl představuje základní mechanismus negativní zpětné vazby Wnt/β-kateninové dráhy. (iii) CEP164, centrosomální protein. CEP164 byl identifikován jako nový protein, který se váže na Dvl. Spojení mezi CEP164 a Dvl poukazuje na důležitou roli Dvl v biologii centrosomu. Tyto objevy napomáhají k dalšímu pochopení funkce Dvl a umožňují lépe oddělit jednotlivé molekulární události řídící hlavní větve Wnt signálních drah.

Abstract:

Wnt signaling pathways are highly conserved signaling cascades, which regulate fundamental aspects of embryonic development and adult homeostasis. All the known Wnt ligands are known to transduce signals via receptor Frizzled (Fzd) and cytoplasmic phosphoprotein Dishevelled (Dvl). Wnt pathways are classified as a Wnt/β-catenin (canonical) and non-canonical Wnt pathways. Mechanisms controlling different branches of Wnt pathways are not clear but it is believed that Dvl acts as a key switch. Dvl functions as a molecular scaffold, which enables interaction of upstream activator proteins and downstream effectors in individual pathways. Dvl activity is controlled by different post-translational modifications such as ubiquitination and phosphorylation. Despite the well documented importance of Dvl in the Wnt signaling, the molecular signal transduction mechanisms activating Dvl in individual Wnt pathways are yet to be elucidated. In order to understand endogenous Dvl function we have analyzed in the unbiased way the activity and composition of Dvl-bound protein complexes. We employed immunoprecipitation of endogenous Dvl coupled to mass spectrometry (IP-MS) as the main tool of the study. We have identified many known Dvl interactors along with novel Dvl interacting partners. Specifically, we have functionally validated three novel proteins, which bind Dvl. These include: (i) Tiam1, a Rac1 GEF. We demonstrated that Tiam1 controls Wnt/Dvl-driven activation of Rac1 in the non-canonical Wnt pathway and show that Tiam1 is required for non-canonical Wnt pathway leading to the differentiation of dopaminergic neurons. (ii) Huwe1, an E3 ligase. We identified Huwe1 as another novel Dvl interacting partner and demonstrate that Huwe1-controlled ubiquitination of Dvl represents an integral part of the negative feedback loop in the Wnt/β-catenin pathway. (iii) CEP 164, a centrosomal protein. CEP164 was identified as novel Dvl interacting protein. The link between CEP164 and Dvl points towards the important role of Dvl in the biology of centrosome. These finding contribute to our understanding of Dvl function and allow to better discriminate individual molecular events driving major branches of the Wnt signaling pathway.

Keywords

Dishevelled, Ubiquitination, E3 ligases, GEFs, MS/MS, Wnt signaling

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 4. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 25. 4. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
• Reader: Pascale Zimmermann, Ph.D., Mgr. Dalibor Blažek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology