Nadexprese dimethylallytryptophansynthasy v produkčním kmeni Claviceps purpurea

Bc. Veronika VAŇKOVÁ

Bachelor's thesis

Overexpression of dimethylallyltryptophansynthase in producing strain of Claviceps purpurea

Abstract:

Claviceps purpurea je parazitická houba, produkující námelové alkaloidy, které nacházejí svůj význam ve farmaceutickém průmyslu pro výrobu léčiv. Zvýšená produkce alkaloidů genetickými modifikacemi vybraných kmenů Claviceps purpurea by mohla snížit náklady na výrobu těchto léků. Gen dmaW kóduje enzym 4-dimethylallyltryptophan syntasu, která katalyzuje první krok biosyntetické dráhy alkaloidů, jenž by mohl být zároveň krokem regulačním. A právě nadexprese tohoto genu by mohla vést ke zvýšené produkci námelových alkaloidů. V teoretické části byla za použití uvedené literatury popsána charakteristika rodu Claviceps a životní cyklus C. purpurea produkujících alkaloidy in planta a v submerzní kultuře. Dále byla zpracována kapitola zabývající se námelovými alkaloidy, jejich chemickou strukturou, farmakologickým účinkem, biosyntézou a její regulací. Poslední kapitola teoretické části je zaměřena na vybrané metody analýzy námelových alkaloidů. V praktické části práce byla provedena transformace protoplastů C. purpurea produkčního kmene P1 konstrukty pNDH-OGG::dmaW (vektor obsahující dmaW z C. purpurea 20.1 fúzovaný na N konci s gfp pod konstitutivním OliC promotorem) a pNDH-OGG (vektor obsahující gfp pod konstitutivním OliC promotorem), tento druhý vektor sloužil jako kontrolní. Cílem této transformace bylo zvýšit expresi genu dmaW a tím zvýšit produkci alkaloidů v submerzní kultuře. Úspěšnost transformace byla potvrzena pomocí diagnostické PCR. Přibližný obsah námelových alkaloidů v myceliu a mediu získaných houbových kultur byl stanoven Van Urk testem, zatímco metodou HPLC byl stanoven přesný kvalitativní i kvantitativní obsah alkaloidů. Bylo zjištěno, že nadexprese enzymu katalyzujícího první krok biosyntézy námelových alkaloidů může zvýšit produkci těchto látek.

Abstract:

Claviceps purpurea is a phytopathogenic fungus producing ergot alkaloids, whose purpose can be found in the pharmaceutical industry in the pharmaceuticals manufacturing. An increased production of alkaloids by genetic modifications of selected strains of Claviceps purpurea could reduce the manufacturing costs of these pharmaceuticals. DmaW gene encodes an enzyme 4-dimethylallyltryptophansynthase, which catalyzes the first step of alkaloid biosynthetic pathway, which could also be the step of regulation. The overexpression of this gene could lead to increased production of ergot alkaloids. In a theoretical part of the thesis, using the mentioned literature, the characteristic of the Claviceps genus and the life cycle of C. purpurea producing alkaloids in planta and in a submerged culture are described. Next chapter introduces ergot alkaloids, their chemical structure, pharmacological effect, biosynthesis and its regulation.The last chapter of the theoretical part specifies the selected methods of analysis of ergot alkaloids. The practical part of the thesis is focused on the transformation of protoplasts of theproducing strain P1 of C. purpurea with constructs pNDH-OGG::dmaW (a vector containing dmaW from C. purpurea 20.1 fused at N-terminal to gfp under the constitutive OliC promoter) and pNDH-OGG (a vector containing gfp under the constitutive OliC promoter), this vector was used as a control. The purpose of this transformation was to increase the expression of dmaW gene and thereby increase the production of alkaloids in the submerged culture. A success of the transformation was confirmed by diagnostic PCR. An approximately ergot alkaloids content in mycelium and in a medium of procured fungal cultures was determined by Van Urk test, while HPLC method was used for determination of an exact qualitative and quantitative content of alkaloids. This research led to a conclusion that overexpression of an enzyme catalysing the first step of ergot alkaloids biosynthesis can increase the production of these substances.

Keywords

Claviceps purpurea, námelové alkaloidy, transformace, dimethylallyltryptophan syntasa

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2018
• Supervisor: Mgr. Michaela Králová

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology