Imunochemická detekce a kvantifikace antimikrobiálních peptidů

Bc. Pavlína BOTÍKOVÁ

Master's thesis

Immunochemical detection and quantification of antimicrobial peptides

Abstract:

Antimikrobiální peptidy jsou velice významnou složkou ochrany vyskytující se napříč všemi organismy. Velice důležitou roli přestavují v humorální imunitě živočichů. Tato diplomová práce je zaměřena především na hmyzí antimikrobiální peptidy. Je popsána obecná struktura antimikrobiálních peptidů, mechanismus jejich vzniku a účinku a případné rozdělení. Rovněž jsou popsány antimikrobiální peptidy, které se vyskytují u včely medonosné, jelikož jejich detekcí se zabývá následná experimentální část. V této části byly antimikrobiální peptidy obsažené ve včelí hemolymfě nejprve separovány pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu s následným Western blotem. Separované peptidy byly identifikovány metodou nLC-MALDI-TOF v příslušných oblastech molekulové hmotnosti získaných na základě imunochemické detekce. Identifikovány byly peptidy defensin-1 a hymenoptaecin. Abaecin nebylo možno tímto způsobem prokázat. Tímto tak byla ověřena specifita primárních protilátek cílených na dané peptidy, jichž bylo následně použito pro optimalizaci detekce peptidů ELISA metodou. Optimalizace ELISA metody pro vhodné stanovení daných antimikrobiálních peptidů probíhala v několika krocích, kdy bylo optimalizováno vhodné ředění jednotlivých protilátek specifických pro každý peptid a také sekundární protilátky, stejné pro všechny peptidy. Dále byly optimalizovány vhodné podmínky pro správný průběh imobilizace antigenu na povrch jamek a rovněž byl zkoumán vliv stáří roztoku pro přípravu chromogenního substrátu na výslednou absorbanci. Optimalizovaný postup metody byl vyzkoušen jak na vzorcích včelí hemolymfy, tak i na vzorcích proteinových extraktů z rozlišných částí včelího těla. ELISA metoda byla vyhodnocena jako další vhodná technika pro detekci a kvantifikaci antimikrobiálních peptidů.

Abstract:

Antimicrobial peptides are a very significant component of immune protection occurring across all organisms. They play a very important role in the humoral immunity of animals. This diploma thesis is focused mainly on insect antimicrobial peptides. It describes the general structure of antimicrobial peptides, the mechanism of their formation, their effect, and possible division. Antimicrobial peptides that occur in honey bees are also described, as their detection is addressed in the following experimental section. In this section, the antimicrobial peptides contained in bee hemolymph were first separated by polyacrylamide gel electrophoresis, followed by Western blot. The separated peptides were identified by nLC-MALDI-TOF in the appropriate molecular weight regions obtained by immunochemical detection. The peptides defensin-1 and hymenoptaecin were identified. Abaecin could not be detected by this protocol. Thus, the specificity of the primary antibodies targeted to the given peptides was verified, it was subsequently used to optimize the detection of peptides by ELISA. The optimization of the ELISA method for the appropriate determination of the given antimicrobial peptides took place in several steps, when the appropriate dilutions of individual antibodies specific for each peptide as well as secondary antibodies, were tested and evaluated. Furthermore, suitable conditions for the antigen immobilization on the surface of the wells were optimized and the effect of the age of the solution for the preparation of the chromogenic substrate on the resulting absorbance was investigated. The optimized procedure of the method was tested both on samples of bee hemolymph and on samples of protein extracts from different parts of the bee body. The ELISA method was evaluated as another suitable technique for the detection and quantification of antimicrobial peptides.

Keywords

Antimikrobiální peptidy, abaecin, defensin, hymenoptaecin, ELISA, Western blot, včela medonosná

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry