Effect of hypoxia on embryonic stem cells

Mgr. Jan Kučera, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Snížená hladina kyslíku (hypoxie) představuje důležitý faktor v regulaci kmenových buněk a hypoxií indukovaný faktor 1 (HIF-1) hraje nejvýznamnější roli v řízení buněčné odpovědi na hypoxii. Embryonální kmenové buňky (embryonic stem cells, ES buňky) jsou odvozeny z časného embrya, které se přirozeně nachází v hypoxickém prostředí, a jsou charakteristické svojí neomezenou proliferací a schopností diferencovat v deriváty všech zárodečných listů. V předkládané práci se zaměřujeme na význam in vitro kultivace kmenových buněk v hypoxii nebo v přítomnosti látek, které hypoxii napodobují. Podrobně se zabýváme vlivem hypoxie a HIF-1 na změny v signálních drahách, které jsou zodpovědné za udržení nediferencovaného stavu myších ES buněk. Dále se v této práci věnujeme vlivu inhibice NADPH oxidázy (NOX) na signalizaci kmenových buněk, neboť změny v hladině reaktivních metabolitů kyslíku (reactive oxygen species, ROS) mají důležitou úlohu v buněčné signalizaci a ovlivňují další osud těchto buněk. Myší ES buňky jsou standardně kultivovány v médiu s přídavkem séra a leukemii inhibujícího faktoru (LIF) v normoxii (~20 % kyslíku). Z našich výsledků vyplývá, že pokud jsou stejné kultivační podmínky aplikovány v 1 % hladině kyslíku, dochází k poklesu genové exprese znaků spojených s nediferencovaným stavem. Hypoxie tedy nepodporuje nediferencovaný stav a kmenovost ES buněk. Podobně hypoxie nebo chemicky navozená hypoxie působí i na ES buňky, které jsou kultivovány bez LIF, a tudíž spontánně diferencují. I zde se neprokázal pozitivní vliv hypoxie na zvrácení či pozdržení nástupu diferenciace a posílení kmenovosti ES buněk. Hypoxie zde naopak vedla k oslabení proliferace a celkovému útlumu genové exprese. V normoxii jsou signální dráhy MAPK/ERK, PI3K/Akt a STAT3 fosforylované, a tudíž aktivované. Kultivace v 1 % kyslíku po dobu 24h vedla k defosforylaci signálních drah ERK a Akt nezávisle na HIF-1. Naproti tomu fosforylace STAT3 zůstala působením hypoxie nezměněna. Inhibice proteinové fosfatázy 2A zvrátila defosforylaci ERK i Akt vyvolanou hypoxií a je tudíž jedním z možných regulátorů signalizace ES buněk v hypoxii. Dále jsme v této práci prokázali, že exprese NOX je u ES buněk velice nízká. Použití inhibitorů NOX tak vedlo k překvapivému zvýšení hladiny ROS a oslabení proliferace. Inhibitor diphenyleneiodonium (DPI) vedl k aktivaci ERK a Akt, zatímco apocynin (APO) silně inhiboval fosforylaci Akt a vedl k poklesu hladiny transkripčního faktoru Nanog a dále ke změnám v signalizaci Wnt. Z výsledků předkládané práce vyplývá, že hypoxie nepodporuje nediferencovaný stav a vede k HIF-1-nezávislému poklesu aktivity signálních drah ERK a Akt u ES buněk. Použité inhibitory NOX zvyšují v ES buňkách hladinu ROS, oslabují proliferaci a vedou ke změnám v signalizačních kaskádách důležitých pro udržení nediferencovaného stavu, nezávisle na svojí funkci NOX inhibitorů. Tyto znalosti mohou přispět k optimalizaci kultivačních podmínek pro kmenové buňky a k jejich potenciálnímu využití v regenerativní medicíně či jako modelu časné embryogeneze. Důkladné pochopení biochemických mechanismů a procesů, které regulují buněčnou signalizaci v hypoxii, může mít dopad na léčbu rakoviny, kardiovaskulárních chorob a dalších nemocí spojených s nedostatkem kyslíku.

Abstract:

Hypoxia is involved in the regulation of stem cells and hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) is recognized as a master organizer of hypoxic response. Embryonic stem (ES) cells are derived from early embryos, which are developing in hypoxic environment, and characterized by unlimited proliferation and the capacity to differentiate into derivatives of all lineages. In this thesis, we analyzed outcome of in vitro mouse ES cells cultivation in hypoxia and in the presence of drugs that mimic hypoxia. Further, we focused on the influence of hypoxia and HIF-1 on alterations in intracellular signaling pathways responsible for mouse ES cells maintenance. Additionally, we examined the effect of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase (NOX) inhibitors on cell signaling, as the modulation of reactive oxygen species (ROS) also influences signal transduction and stem cell fate. Conditions for maintenance of mouse ES cells include cultivation in normoxia, in medium with leukemia inhibitory factor (LIF) and serum. Hypoxia did not support undifferentiated phenotype of ES cells under these conditions, according to decrease in gene expression of selected stem cell markers. Similarly, hypoxia or HIF stabilization did not show any supportive features of stemness maintenance, such as prevention or delayed onset of differentiation, in LIF-depleted spontaneously differentiating ES cells and instead resulted in proliferation impairment and general gene expression attenuation. In normoxia mitogen-activated protein kinase/ extracellular-signal-regulated kinases (MAPK/ERK), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-3-kinase/Akt (PI3K/Akt) and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) pathways are phosphorylated and, hence, active. Cultivation in 1 % O2 for 24h resulted in strong dephosphorylation of ERK and Akt in HIF-1α-independent manners. On the contrary, STAT3 phosphorylation remained unaffected by hypoxic cultivation. Inhibition of protein phosphatase 2A (PP2A) reverted dephosphorylation of ERK as well as Akt, suggesting its potential role in the regulation of ES cells in hypoxia. Finally, we demonstrated that expression of NOX in ES cells is very low and that NOX inhibitors induce ROS production and impair proliferation. Further, we reported that treatment with diphenyleneiodonium (DPI) activates ERK and Akt, while apocynin (APO) promotes strong inhibition of Akt phosphorylation accompanied by downregulation of pluripotency regulator Nanog, and modulates Wnt signaling. Conclusively, our data suggest that hypoxia does not support undifferentiated phenotype and leads to HIF-1α-independent downregulation of ERK and Akt signaling in ES cells. APO and DPI promote ROS production, impair proliferation, and affect ES cells signaling independently on their function as NOX inhibitors. Obtained results may enhance our ability to manipulate stem cells and use them as a tool in regenerative medicine or utilize them as a developmental model. Moreover, in-depth knowledge of the biochemical mechanisms underlying the regulation of cell signaling in hypoxia may eventually contribute to defining therapeutic targets in hypoxia-associated diseases and cancer.

Keywords

Hypoxia, embryonic stem cells, phosphorylation, differentiation, MAPK/ERK, Hypoxie, embryonální kmenové buňky, fosforylace, diferenciace

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 3. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 1. 4. 2016
• Supervisor: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.
• Reader: prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D., doc. RNDr. Pavla Jendelová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology