Beta testování kitu PyroMark Q48 FX Age Assay (QiaGen)

Bc. Eliška HAASOVÁ

Master's thesis

Beta testing of PyroMark Q48 FX Age Assay kit (QiaGen)

Abstract:

Methylace DNA je epigenetická modifikace, která má velký potenciál pro forenzní účely. Na základě methylace DNA lze ve forenzní praxi určit bližší údaje o analyzovaném vzorku (identifikace tělních tekutin a tkání) a o inkriminované osobě (určení fenotypových charakteristik, zdravotního stavu, životního stylu, stáří). Zejména determinace věku jedince je v kriminalistické praxi velmi důležitá. Pro určení úrovně methylace se využívají různé metody (bisulfitické sekvenování, metody založené na restrikčních endonukleasach, metody založené na afinitních mikročipech). Firma QIAGEN vyvinula epigenotypizační kit PyroMark Q48 FX Age Assay pro určování věku jedinců na základě polského výzkumu, který využívá techniky bisulfitického pyrosekvenování (spojení bisulfitické konverze s genotypizací pomocí pyrosekvenování). V experimentální části této diplomové práce bylo provedeno beta testování druhé verze zmíněného kitu pro ověření jeho přesnosti na vzorcích kontrolní DNA od firmy QIAGEN a na 232 vzorcích DNA vyizolovaných z periferní krve českých dárců krve. Část testování byla provedena v rámci mezinárodní spolupráce, kterého se zúčastnily forenzní laboratoře z Dánska, Francie, Německa a USA. Úroveň methylace byla stanovena u každého vzorku u pěti markerů na konkrétních CpG místech (CpG7 pro ELOVL2, CpG1 pro C1orf132, CpG7 pro TRIM59, CpG1 pro KLF14 a CpG2 pro FHL2). Na základě těchto hodnot byl pomocí věkového kalkulátoru od firmy BioVectis určen odhadovaný věk daného jedince. Data byla posléze statisticky analyzována a srovnána s 1. verzí kitu. Bylo zjištěno, že 2. verze kitu má mnohokrát vyšší přesnost než 1. verze. Střední absolutní odchylka byla stanovena na 3,21 let pro všechny vzorky. Nejvyšší hodnota střední absolutní odchylky byla zaznamenána u nejstarší věkové skupiny 50-63 let, a sice 4,18 let. Kit vykazoval poměrně slabou korelaci mezi jednotlivými markery a chronologickým věkem až na marker FHL2. Korelace mezi odhadovaným a chronologickým věkem byla naopak poměrně vysoká, a to 88,4 %.

Abstract:

DNA methylation is an epigenetic modification that has great potential for forensic purposes. Based on DNA methylation, data on the analysed sample (identification of body fluids and tissues) and on the incriminated person (determination of phenotypic characteristics, health status, lifestyle, and age) can be determined. Determining the age of an individual is very important in forensic practice. Various methods are used to determine the level of methylation (bisulfite sequencing, methods based on restriction endonucleases, methods based on affinity microarrays). QIAGEN developed the PyroMark Q48 FX Age Assay epigenotyping kit for determining the age of individuals based on Polish research using bisulfite pyrosequencing techniques (combining bisulfite conversion of cytosine with genotyping by pyrosequencing). In the experimental part of this master´s thesis, beta testing of this kit was performed to verify its accuracy on control DNA samples from QIAGEN and on 232 DNA samples isolated from the peripheral blood of the Czech blood donors. Part of the testing was carried out in an international collaboration involving forensic laboratories from Denmark, France, Germany, and the USA. The level of methylation was determined for each sample for five markers at specific CpG sites (CpG7 for ELOVL2, CpG1 for C1orf132, CpG7 for TRIM59, CpG1 for KLF14, and CpG2 for FHL2). Based on these values, the estimated age of the individual was determined using an age calculator from BioVectis. The data were then statistically analysed and compared with the first version of the kit. It has been discovered that the second version has several times higher accuracy than the first version. The mean absolute deviation was set at 3,21 years for all samples. The highest value of the mean absolute deviation was observed for the oldest age group 50-63 years, namely 4,18 years. The kit showed a relatively weak correlation between individual markers and chronological age except the FHL2 marker. On the other hand, the correlation between estimated and chronological age was quite high, namely 88,4%.

Keywords

forenzní epigenetika, methylace DNA, určování věku, bisulfitická konverze, pyrosekvenování

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology