Biochemické mechanismy toxicity cyanobakterií

RNDr. Kateřina Nováková, Ph.D.

Doctoral thesis

Biochemical mechanisms of cyanobacterial toxicity

Abstract:

Masivní rozvoj sinic je celosvětovým problémem zejména díky antropogenní trofizaci vod. Tyto photoautotrofní organismy jsou schopny produkovat široké spektrum rozdílných látek, jak chemickou strukturou, tak i biologicky aktivními vlastnostmi, např. antibakteriální, cytotoxické, biocidní, genotoxické, nádorově promoční nebo naopak protinádorové. Některé z těchto metabolitů jsou považovány za zdravotně nebezpečné, jedná se zejména o cyanotoxiny (microcystin a cylindrospermopsin). Avšak hromadící se studie predikují existenci nových metabolitů, které mají podobný toxický potenciál jako cyanotoxiny. Tato dizertace je rozdělena do dvou tématických kapitol zaměřených na interakce mezi toxickými sinicemi s dalšími vodními autotrofními organismy (př. řasy) a na karcinogenitu způsobenou známými cyanotoxiny ale i neznámými metabolity. Experimentální část práce je zpracována do čtyř vědeckých článků a dvou manuskriptů. Většina uvedených studií se přistupuje k toxicitě sinic jako ke komplexním směsím (intracelulární a extracelulární) ve srovnání s toxicitou jednoho cyanotoxinu (microcystinu nebo cylindrospermopsinu). V první části dizertace je zkoumána role microcystinu jako signální molekuly nebo látky s alelopatickým účinkem. Také bylo sledováno ovlivnění biochemických parametrů u zelené řasy způsobené komplexními směsmi sinic (intra- a extracelulární směsi). Alelopatické vlastnosti microcystinů nebyly našimi výsledky potvrzeny (žádné ovlivnění růstu zelených řas a sinic na environmentálně relevatních koncentracích). Pozorované účinky byly způsobeny extrémně vysokými koncentracemi microcystinů (1000-25000 µg/l), odpovědi fotoautotrofních organismů se lišily mezi druhy a také dle typu microcystinu (MC-LR nebo MC-RR). Avšak sinicový extrakt s relevatními hladinami microcystinů (2-20 µg/l) vyvolal změny v buněčné diferenciaci jednoho druhu sinice, což částečně nahrává teorii o jeho funkci signální molekuly. Experiment reflektující reálnou situaci v přírodě, kde je microcystin přítomen ve směsi s dalšími metabolity, srovnává vliv komplexních směsí sinic (intra- a extracelulární) s účinkem čistého microcystinu na biochemické parametry u zelené řasy. Všechny testované směsi ovlivnily sledované biomarkery, avšak byly pozorovány různé účinky. Další experimentální část je zaměřena na zjištění možného potenciálu vyvolat rakovinu u komplexních směsí různých kmenů a druhů sinic pomocí biotestu založeného na ovlinění mezibuněčné komunikace štěrbinovými spoji (gap junctional intercellular communication-GJIC), jejíž inhibice je zavedený parametr vedoucí k promoci nádorů. Následuje studie sledující možnou potenciaci účinků směsi extraktů sinic a antropogenních polutantů pomocí GJIC testu. Další experiment detailně charakterizuje a popisuje neznámou látku/látky s nádorově promočními vlastnostmi, která/é jsou extracelulárně produkované sinicí Cylidrospermopsis raciborskii. Naše výsledky ukázaly, že produkce nádorově promočních látek (odlišných od známých metabolitů-microcystinu a cylindrospermopsinu) je druhově specifická a take se liší mezi různými kmeny sinic. Nejsilnější účinek na GJIC byl způsoben extracelulární směsí C. raciborskii, který byl dále frakcionován a charakterizován. Po podrobné chemické analýze byla objevena látka o molekulové hmotnosti 321,2, která je přítomna jen v aktivní frakci (inhibující GJIC) a také je pravděpodobně zodpovědna za utlumení GJIC. Tato dizertace přispívá k pochopení molekulárních, buněčných a biochemických mechanismů spojených s toxicitou, která je způsobena různými metabolity sinic- nejen známými toxiny ale také nově identifikovanými metabolity. V této práci je také zmíněna d

Abstract:

ůležitost studia zabývajícího se přírodně relevantními směsmi toxických látek produkovaných sinicemi.

Abstract:

Massive development of cyanobacteria as result of water trophization by nutrients due to anthropogenic activity is a worldwide problem. These photoautotrophic organisms are able to produce wide spectrum of chemically and structurally different compounds with various biologically active properties such as cytotoxic, biocidous, genotoxic, tumor promoting or anticancer, where some of them are considered as human health hazardous. Most studies investigated identified cyanobacterial metabolites, especially cyanotoxins (microcystins and cylindrospermopsin). But there is a cumulating evidence of cyanobacterial toxicity not associated with known cyanotoxins, which indicates existence of novel metabolites with toxic properties similar to cyanotoxins. This thesis is divided into two major thematic topics covering interactions between toxic cyanobacteria and other aquatic autotrophic organisms such as algae as well as carcinogenicity of both known cyanotoxins and unknown metabolites. Presented results are based on four publications and two manuscripts, most of the studies deal with cyanobacterial toxicity as complex mixtures (intracellular and extracellular), which is more relevant scenario in contrary to traditional toxicological studies with isolated cyanobacterial metabolites. In the first part of the thesis the role of microcystins as signaling molecule or allelochemical and their effects on growth and cell differentiation in phytoplanktonic species are discussed. Also comparison of modulations on biochemical markers caused by complex mixtures (intra- and extra-cellular) and pure microcystins in green alga were studied. The allelopathic property of microcystins was not confirmed by our results (no growth effects on green algae and cyanobacteria at environmentally relevant concentrations). Observed effects caused by extremely high concentrations (1000-25000 µg/l) were species-specific and demonstrated various responses of photoautotrophic organisms to two microcystin congeners (MC-LR and MC-RR). Interestingly, cyanobacterial extract with microcystins concentration at relevant levels (2-20 µg/l) influenced cell differentiation, thus partially play to microcystin signaling hypothesis. More natural situation, where is microcystin present in mixture of other metabolites, evinced experiments with complex cyanobacterial mixtures (intra- and extra-cellular) and pure microcystins, where all samples altered measured biochemical parameters but with different effects. Second part of the thesis is focused on evaluation of possible carcinogenic potential of complex mixtures of various cyanobacterial strains (intra- and extracellular) using in vitro bioassay with established tumor promotion marker - gap junctional intercellular communication (GJIC). Tumor promoting potentiation of co-exposure of cyanobacteria and anthropogenic pollutants as well as characterization and description of novel tumor promoting compound extracellularly produced by cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii were also devoted in this work. Our results showed species–specific and strain-specific production of tumor promoting compounds different from known cyanotoxin (microcystins and cylindrospermopsin). The strongest effects were caused by extracellular mixture of C. raciborskii which was further fractionated and characterized causative agents. After the detailed analyses, a compound with m/z 321.2 was identified as potential agent causing inhibition of GJIC as it was present in active but not non-active fractions. The present thesis contributes to our understanding of molecular, cellular and biochemical mechanisms behind the toxicity of various cyanobacterial metabolites including known toxins as well as newly identified metabolites. The importance of studying naturally relevant mixtures of toxic compounds is highlighted.

Keywords

sinice, sekundární metabolity, alelopatie, fotoautotrofové, nádorová promoce, cyanotoxiny, buněčná komunikace, oxidativní stress, buněčná diferenciace, exudát, směsi

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 2. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 2. 4. 2012
• Supervisor: prof. RNDr. Luděk Bláha, Ph.D.
• Reader: RNDr. Pavel Hrouzek, Ph. D., Prof. Dr. Zorica Svircev, Dr. Brad L. Upham

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Environmental Chemistry