Interakce DNA s protinádorově účinnými vícejadrnými komplexy platiny

Mgr. Jana Zehnulová, Ph.D.

Doctoral thesis

DNA Interactions of Novel Antitumor Polynuclear Platinum Complexes

Abstract:

V současné době se při vývoji nových léčiv stále více prosazují tendence navrhovat nová terapeuticky efektivnější léčiva s přihlédnutím ke znalosti mechanismu, kterým tyto nové látky nebo látky příbuzné realizují svůj farmakologický efekt. Tato strategie se uplatňuje také při vývoji nových platinových cytostatik, které by na rozdíl od cisplatiny měly méně nežádoucích účinků a širší spektrum protinádorové účinnosti. Výsledkem tohoto úsilí byl vývoj vícejaderných komplexů platiny, jejichž nejvýznamnějším představitelem je trojjaderný platinový komplex BBR3464, který úspěšně vstoupil v roce 2000 do 2. fáze klinických testů. Z výše zmíněných důvodů má velký význam studium aktivity tohoto komplexu na úrovni DNA, která je cílovým místem protinádorového účinku platinových cytostatik. V této práci byla popsána konformační analýza oligodeoxyribonukleotidových duplexů obsahující jediný specifický adukt BBR3464. Mezi studované adukty patřily můstky uvnitř jednoho řetězce (tzv. vnitrořetězcové můstky) a meziřetězcové můstky. Struktura aduktů byla potvrzena reakcí s dimethylsulfátem a konformační distorze byly detekovány pomocí chemických sond. Ke zjištění úhlu ohybu a rozvíjení DNA bylo využito elektroforézy multimerů připravených z oligonukleotidů, z nichž každý obsahoval pouze jediný adukt. Výsledky ukazují, že na rozdíl od cisplatiny tvoří tento komplex můstky lišící se svou délkou v rozsahu od 1,2- vnitrořetězcového a meziřetězcového můstku až po 1,6-vnitrořetězcový či meziřetězcový můstek, které jsou označovány jako tzv. můstky delšího dosahu mezi bázemi v DNA. Nejprve byly studovány vnitrořetězcové můstky, které jsou majoritním aduktem tvořeným komplexem BBR3464 na DNA. Pro jejich studium byly navrženy oligonukleotidové duplexy tak, aby umožňovaly vznik 1,2-, 1,3- a 1,5 vnitrořetězcových můstků. Ke sledování rozdílů v charakteru distorzí vyvolaných 1,2-, 1,3- a 1,5 vnitrořetězcovými můstky byly použity chemické sondy. Z reaktivity chemických sond KMnO4, DEPC a KBr/KHSO5 lze usoudit, že vznikem těchto aduktů dochází k lokální asymetrické konformační distorzi, která je výraznější na 5 straně aduktu a rozsah této distorze je 4 - 5 bp. Navíc vnitrořetězcové můstky komplexu BBR3464 na rozdíl od stejných aduktů cisplatiny (tj.1,2- a 1,3-vnitrořetězcových můstků) neohýbají osu dvoušroubovice, proto nebylo překvapující zjištění, že tyto adukty nejsou rozpoznávány HMGB1 proteiny, které hrají významnou roli ve zprostředkování protinádorového účinku cisplatiny. Tento výsledek podporuje hypotézu, že reakce nádorových buněk na vznik můstků vytvořených komplexem BBR3464 v jednom řetězci DNA nesouvisí s protinádorovou aktivitou tohoto cytostatika tak, jak je tomu v případě cisplatiny. Navíc bylo zjištěno, že tyto adukty byly snadno odstraňovány nukleotidovou excizní opravou. BBR3464 také snadno tvoří meziřetězcové můstky. Pro jejich studium byly vybrány duplexy, ve kterých 1,2-, 1,4- a 1,6-meziřetězcové můstky mohou být tvořeny v 33 nebo 55 směru. Celkem neočekávaně jsou 1,2-meziřetězcové můstky tvořeny výhradně v 33 směru, ale 1,4- a 1,6 meziřetězcové můstky mohou vznikat v obou směrech. Byla také studována kinetika tvorby 1,2-, 1,4- a 1,6-meziřetězcových můstků. Zjistilo se, že 1,6 meziřetězcový můstek vzniká mnohem pomaleji než 1,2- a 1,4-meziřetězcové můstky, tudíž i význam tohoto aduktu pro protinádorovou účinnost BBR3464 bude patrně menší. Navíc byly připraveny 1,4-meziřetězcové můstky obsahující adukt pouze v jednom směru, buď v 33 nebo 55 a byly porovnány ohyby a distorze vyvolané těmito můstky. Z reaktivity chemických sond DEPC, KBr a KMnO4 lze usoudit, že vznikem 1,4 meziřetězcov

Abstract:

ých můstků dochází k asymetrické lokální konformační distorzi v okolí platinovaných guaninů, která se nachází převážně na 5 straně aduktu a na párech bází mezi platinovanými guaniny. Pro 1,4-meziřetězcový můstek v 55 směru je charakteristický ohyb podélné osy DNA o 15o směrem do velkého žlábku, rozvinutí DNA o 14o a asymetrická distorze v rozsahu 4 bp. U aduktu tvořeného v opačném směru vzniká ohyb podélné osy DNA o 21o směrem do velkého žlábku, rozvinutí DNA o 14o a podobná distorze jako u předchozího aduktu. Tyto adukty nejsou rozpoznávány HMGB1 proteiny. Přítomnost širokého spektra meziřetězcových můstků tvořených komplexem BBR3464 může mít velký význam pro protinádorovou účinnost komplexu tím, že může klást větší nároky na opravné mechanismy. V této práci bylo potvrzeno, že meziřetězcové můstky nejsou odstraňovány nukleotidovou excizní opravou. V třetí části disertační práce byl studován vliv odstupující skupiny na charakteristiky vazby na DNA u dvojjaderných komplexů se spermidinovým řetězcem. U komplexu s odstupujícími chloridovými ligandy (BBR3571) byla zaznamenána rychlá kinetika reakce s DNA, bifunkční způsob vazby na DNA, úhel rozvíjení 12o, stejná schopnost tvořit meziřetězcové můstky jako u BBR3464 . Modifikace komplexem BBR3571 vedla k vyšší opravné aktivitě než při modifikaci cisplatinou. U komplexu SET3009, který obsahuje jako odstupující skupiny dusitanové ligandy, byla zjištěna pomalá kinetika vazby na DNA, převážně monofunkční způsob vazby na DNA, malý úhel rozvíjení, nižší opravná aktivita po modifikaci komplexem, která byla zjištěna při experimentech s nukleotidovou excizní opravou. Provedené experimenty přinesly cenný poznatek, že pouhá záměna odstupující skupiny může znamenat velký rozdíl ve způsobu vazby na DNA.

Abstract:

Nowadays a development of new drugs is based on knowledge of the mechanism of their action. This strategy is used also for anticancer platinum drug design of compounds with different activity and decreased toxicity from cisplatin. In the design of these new drugs, polynuclear platinum complexes have raised great interest. The lead representative of this new structural class of anticancer agents is the trinuclear platinum complex BBR3464 that entered phase II of clinical trials in 2000. The study of complex DNA interaction is important for establishing the structure-activity relationship of this compound , that will be useful for further development of these drugs. In this work I focused on analysis of oligodeoxyribonucleotide duplexes containing single, site-specific intrastrand and interstrand adducts that differ in the length of the cross-link. The structure of adducts was confirmed by dimethylsulfate footprinting. DNA distortions, bending and unwinding associated with the formation of these adducts were studied by means of chemical probes of DNA conformation (such as KMnO4, DEPC, KBr and KHSO5) and phasing assay based on gel electrophoresis. Results suggest, that BBB3464 is able to form long-range delocalized lesions on DNA ranging from 1,2-intrastrand or interstrand cross-link up to 1,6-intrastrand or interstrand cross-link, which are different from the cross-links formed by cisplatin. The major adducts formed on DNA by BBR3464 are intrastrand cross-links. I have chosen for this study the duplexes, in which 1,2-, 1,3- and 1,5-intrastrand cross-links could be formed These adducts induce in DNA assymetrical distortions, that mainly occur on the 5 side of the cross-link and in the case of 1,3- and 1,5 intrastrand cross-links also on the base pairs between the platinated guanine residues. These distortions extend over 4-5 bp . They dont induce rigid bending of helix axis, thus it wasnt surprising that it was observed in the present work that they are not recognized by HMG domain proteins, that mediate antitumor activity of cisplatin. It was revealed in this work the intrastrand adducts are readily removed from DNA by nucleotide excision repair. BBR3464 also readily forms interstrand cross-links. I have chosen for this study the duplexes, in which 1,2-, 1,4- and 1,6-interstrand cross-links could be formed in the 55 or 33 direction. Quite unexpectedly, 1,2 interstrand cross link is preferentially formed in the 33 direction, but 1,4-interstrand cross-links were formed with approximately the same preference for both 33and 55directions and 1,6 interstrand cross-links were also formed in both directions, but with a clear preference for the 55 direction. It results from the study of the kinetics of an interstrand cross-link formation that the 1,6 interstrand cross-link (platinated guanine residues were separated by 6 bp) is formed with a pronouncedly lower rate when compared to the kinetics of the formation of 1,2- and 1,4 interstrand cross-links, so that it is reasonable to suggest that the 1,6 interstrand cross-link represents less frequent adduct of BBR3464. In addition, single 1,4 interstrand cross-links in the 33 and 55 directions were prepared and differences in bending and distortions induced by these lesions were studied. The 1,4 interstrand cross-link in the 55 direction bends the helix axis by 15o toward the major groove, unwinds DNA by approximately 14o. Despite these small bending and unwinding effects this 1,4-interstrand cross-link formed by BBR3464 created a local conformational distortions revealed by the chemical probes. This distortion was asymmetrical, more extensive on the 5 side of the adduct and exceeded over ~4 bp. The 1,4 interstrand cross-link formed in the opposite direction induces bending of the helix axis by 21o toward the major groove, duplex unwinding by 14o and similar distortion as described for the previous adduct. No recognition of the interstrand cross-links of BBR3464 by HMGB1 proteins was observe

Abstract:

d in this work. The wider spectrum of interstrand cross-links formed by BBR3464 could pose a special challenge to repair enzymes and have an impact on biological activity of compound. In this work the examination of excision repair of the 1,4-interstrand cross-links has revealed that these adducts cannot be removed from DNA by nucleotide excision repair. DNA binding characteristics of two dinuclear platinum compounds with different leaving groups were compared in the third part of the PhD thesis. For the compound BBR3571 with leaving chloride groups it was determined that the DNA binding is rapid and bifunctional, the unwinding angle is about 12o, DNA interstrand crosslinking efficiency of BBR3571 was 33%, i.e. similar to that of bifunctional, trinuclear complex BBR3464. The adducts of BBR3571 induced a considerably higher level of repair synthesis which was approximately double than that found for the adducts of cisplatin. For the second complex SET3009 that possesses nitrate leaving groups, it was found that it binds with a pronouncedly lower rate, the binding is monofunctional, damage-induced DNA repair synthesis detected in the plasmid modified by SET3009 was slightly lower compared to the synthesis induced by cisplatin. Performed experiments has brought an important piece of information that the leaving group can significantly influence the DNA binding characteristics of antitumor platinum compounds.

Keywords

protinádorové komplexy platiny, DNA, BBR3464, dvojjaderné a trojjaderné komplexy platiny, oligonukleotidy, meziřetězcové můstky, vnitrořetězcové můstky antitumor platinum complexes, dinuclear and trinuclear antitumor complexes, oligonucleotides, interstrand cross-links, intrastrand cross-links

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 6. 2006

Thesis defence

• Date of defence: 28. 6. 2006
• Supervisor: prof. RNDr. Viktor Brabec, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Physics / Biophysics