Molekulární determinace substrátové specifity u rostlinných b-glukozidáz

Mgr. Pavel Mazura, Ph.D.

Disertační práce

Molecular cetermunation of substrate specificity in plat beta-glucosidases

Anotace:

Substrátová specifita enzymů je klíčovou charakteristikou pro katalýzu biochemických reakcí v živých systémech. Předkládaná disertační práce je zaměřena na výzkum substrátové specifity rostlinných β- glukozidáz. Tato skupina proteinů je velmi rozmanitá co se týče homologních enzymů, což umožňuje bioinformatickou analýzu současně s objasněním významu β-glukozidáz zahrnutých v mnoha důležitých procesech růstu a vývoje rostlin. Zejména je řešena otázka, jak je specifita těchto β-glukozidáz strukturně determinována na úrovni funkčních vztahů mezi klíčovými aminokyselinami, které tvoří vstup do aktivního místa enzymu. Modelovým enzymem používaným v této práci je β-glukozidáza Zm-p60.1 z kukuřice. Racionální design v proteinovém inženýrství β-glukozidázy Zm-p60.1 přinesl cenné výsledky o vlivu některých aminokyselin v aktivním místě na substrátovou specifitu. Tyto informace byly vyhodnoceny v kontextu strukturně funkčních dat z výzkumu příbuzných rostlinných β-glukozidáz za použití nových postupů pro popis substrátové specifity. Vzhledem k limitům racionálního designu byl navržen směr výzkumu zaměřený na hledání funkčních kombinací aminokyselin v aktivním centru Zm-p60.1 pomocí řízené evoluce proteinů. V rámci vývoje metody byl vyřešen postup syntézy speciálně degenerovaných primerů, včetně vývoje programu pro odhady vnášené aminokyselinové variability, a velikosti souboru generovaných klonů. Dále byl vyvíjen skríning mutantních klonů na základě glukozidázové aktivity. Přestože vývoj skríningu nebyl dokončen pro výskyt nespecifické aktivity náhodně aktivovaného Bgl operonu, bylo vyselektováno několik nových mutantních forem β-glukozidázy Zm-p60.1., které byly částečně charakterizovány. Pro popis substrátové specifity β-glukozidáz, případně jejich mutantů, je nutné určení jejich katalytických parametrů KM a kcat na umělých a přirozených substrátech. V rámci disertační práce byla vyvinuta metoda pro měření enzymové kinetiky průběžným fluorimetrickým stanovením glukózy jako produktu β-glukozidázové reakce. Pomocí této metody byly stanoveny katalytické parametry hydrolýzy přirozeného substrátu trans-zeatin-O-glukozidu, což přispívá k diskusi o roli β-glukozidázy Zm-p60.1 v hormonálních regulacích rostlin.

Abstract:

The substrate specificity is a key determinant for biochemical catalysis in living systems. The thesis is focused on substrate specificity research of plant β-glucosidases. This protein group includes a high number of homologous enzymes, which enables bioinformatic analysis as well as the basis for discussion about the involvement of these glucosidases in various developmental and growth processes in plants. The main discussed question in the thesis is how the specificity of plant β-glucosidases is structurally determined on the level of structure/function relationships between key amino acids involved in forming the entrance part to the active site. The model enzyme used in this research is a maize β-glucosidase Zm-p60.1 Rational design in protein engineering of β-glucosidase Zm.p60.1 revealed novel insights into determination of substrate specificity by individual amino acids of its active site. Using latest procedures of substrate specificity evaluation, these data were interpreted in the context of structure/function data from the research on related plant β-glucosidases. Taking into account limits of rational design, a new direction of research was introduced and focused on a search for functional combinations of amino acids in the active site of Zm-p60.1 using directed protein evolution method. For this method, procedure for producing specially degenerated primers was developed along with a software for amino acid variability and clone library extent estimation. Screening system based on β-glucosidase activity in mutated clones was being developed. In spite of the fact that development of the screening has not been finished yet due to occurrence of non-specific activity caused by randomly activated Bgl operon, several new Zmp60.1 mutants were produced and partially characterized. For the description of β-glucosidase substrate specificity, the catalytic parametres KM a kcat measured on artificial and natural substrates are necessary. Within the thesis a new method for enzyme kinetic studies of scarce glucosides was developed. The method is based on continuous fluorimetric measurement of glucose released as a product in the course of reaction catalyzed by β- glucosidase. Using this method, kinetic parameters of hydrolysis of trans-zetin-O-glucoside were obtained. These findings contribute to a continuous discussion about the role of Zm-p60.1 in plant hormonal regulation.

Klíčová slova

substrátová specifita, beta-glukozidáza, řízená evoluce, enzymová kinetika substrate specificity, beta-glucosidase, directed evolution, enzyme kinetics

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 10. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 10. 2008
• Vedoucí: prof. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc.
• Oponent: RNDr. Lubica Urbaníková, CSc., Mgr. David Kopečný, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie