Exprese lidských glykosyltransferas v kvasinkách s upravenou glykosylací

Mgr. Marek Adamus

Bachelor's thesis

Expression of human glycosyltransferases in yeast with modified glycosylation

Abstract:

Sacharidy jsou nezbytnou součástí buněčného metabolismu. Podílejí se mimo jiné na přenosu signálů, adhezi buněk a v rámci posttranslačních modifikací se váží na aminokyselinové řetězce proteinů. Takto mohou být stejné proteiny rozeznávány různými látkami díky jejich rozdílné glykosylaci. Enzymy katalyzující tyto reakce se nazývají glykosyltransferasy. Jsou nestabilní, v buňkách se nachází v malých množstvích ve většině případů transmemránově vázané. Tyto skutečnosti ztěžují jejich přípravu a studium. Poruchy v produkci některých glykosyltransferas jsou spojovány s rozvojem různých typů rakovin. Jako modelový enzym pro studium těchto enzymů je využívána N-acetylglukosaminyltransferasa I (GnT-1), která se účastní glykosylace proteinů v Golgiho aparátu. V současné době jsou navrhovány inhibitory katalytické funkce GnT-1, které by mohly na základě homologie struktury působit i na jiné enzymy ze stejné rodiny glykosyltransferas. Tato práce se zabývá produkcí katalytické domény enzymu GnT-1 v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae a Pichia pastoris. Naším úkolem bylo srovnání genové exprese obou systémů a zjištění optimálních podmínek. Za tímto účelem byl vytvořen syntetický gen nesoucí oligohistidinovou kotvu na N-konci proteinu. K tomu jsme z dřívějších neúspěchů přistoupili k přípravě konstruktu s oligohistidinovou kotvou na C konci. Gen byl ligován s komerčním vektorem pPICZαA a vložen do buněk P. pastoris. Bohužel exprese genu nemohla být ověřena. Jiný konstrukt pro expresi v S. cerevisiae pYES2/CT ligovaný s genem GnT-1 byl úspěšně vložen do buněk, u kterých byla indukována produkce katalytické domény enzymu. Přes optimalizace metod detekce nebyl prozatím enzym mezi nativními proteiny organismu identifikován.

Abstract:

Carbohydrates as an essential compound of cell metabolism play a crucial role in cell adhesion, signal transfer or take a part in protein posttranslational modifications. Present on a protein surface they serve as a site of recognition by some other compounds e.g. lectins or antibodies. A transfer of sugar moiety onto a protein surface is catalyzed by enzymes called glycosyltransferases. Due to their low cell concentration, unstability and often membrane occurence they are difficult to study. It was observed that some fluctuations in their cell concentration are connected to cancer. N-acetylglucosaminyltransferase I (GnT-1) is a Golgi resident enzyme often used as an experimental model for some other less stable glycosyltransferases. Based on a structure homology there are newly synthetized GnT-1 inhibitors which may have the similar effect on some other same ezyme family members. In this thesis we study GnT-1 catalytic domain gene expression with C-terminal histidine tag in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris yeast. Although ligation of P. pastoris vector pPICZαA and gene could not be verified, we succeded in transformation of Saccharomyces cerevisiae by pYES2/CT vector with GnT-1 gene. Despite that GnT-1 enzyme among other native yeast proteins has not been identified yet.

Keywords

glykosyltransferasy, kvasinky, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, N-acetylglukosaminyltransferasa I, GnT-1, glykosyltransferases, yeast, N-acetylglucosaminyltransferase I

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 18. 6. 2012
• Supervisor: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry