Charakterizácia vrodených a získaných chromozómových aberácií pomocou techník komparatívnej genómovej hybridizácie s vyšším rozlíšením (HR-CGH) a array-CGH

RNDr. Vladimíra Vranová, Ph.D.

Doctoral thesis

Characterization of constitutional and acquired chromosomal aberrations using high resolution comparative genomic hybridization (HR-CGH) and array-CGH techniques

Abstract:

Unbalanced constitutional and acquired chromosomal aberrations play a major role in pathogenesis of many genetic diseases in human. Due to this fact, methods that enable genome-wide determination of gains and losses of genetic material hold important position in modern cytogenetics. Since 1992, approaches based on comparative genomic hybridization (CGH) have been used. They enable genome-wide analysis of DNA sequence copy number differences in a single experiment. Aim of this dissertation was to establish, optimize and verify sensitivity and specificity of high resolution comparative genomic hybridization (HR-CGH) and array-CGH in detection of unbalanced chromosomal rearrangements in patients of the Department of Medical Genetics, Medical Hospital Brno. In 2004, we developed HR-CGH technique in cooperation with the Laboratory Imaging Ltd., Prague as the first laboratory in the Czech Republic. In order to test sensitivity of this technique, patients with specific microdeletion syndromes were analyzed, and the detection limit was assessed to 4 Mb. To determine a clone prevalence that can be identified by the HR-CGH, verification of HR-CGH results was carried out using FISH method and series of tests with DNA of patients with cytogenetically well-defined congenital chromosomal abnormalities. Both approaches confirmed the ability of HR-CGH to detect unbalanced changes at 20–30 % incidence of aberrant clones in samples. In the next step, the HR-CGH was used to screen clonal chromosomal imbalances in clinical praxis. Constitutional chromosomal changes were studied mainly in patients with mental retardation, developmental delay and/or facial dysmorphism; acquired aberrations were analyzed in patients with glioblastoma multiforme, multiple myeloma, and in children with acute leukaemia. In all cases, the HR-CGH detected not only a higher incidence of chromosomal imbalances but also aberrant clones with a prevalence less than 50 %, and thus allowed more precise characterization and stratification of these malignant diseases. The method of array-CGH represents the latest improvement of the CGH technique. This method was tested and applied in research using both BAC clones (Abbott Molecular Inc.) and oligonucleotides (Agilent Technologies). Using this approach, the first evaluations of patients with costitutional and acquired chromosomal aberrations showed that array-CGH enables not only a better definition of range of genetic changes but also identification of particular genes included in deleted or gained areas.

Abstract:

Vrodené a získané nebalansované chromozómové aberácie tvoria významnú zložku patogenézy mnohých geneticky podmienených ochorení u človeka. Z tohto dôvodu zastávajú dôležité miesto v modernej cytogenetike metódy umožňujúce celogenómovú detekciu ziskov a strát genetického materiálu. Od roku 1992 medzi ne patria metódy založené na princípe komparatívnej genómovej hybridizácie (CGH), ktoré umožňujú detekovať relatívny počet kópií jednotlivých sekvencií DNA medzi rôznymi genómami v jednom hybridizačnom pokuse. Cieľom predkladanej dizertačnej práce bolo zavedenie, optimalizácia a overenie účinnosti metód komparatívnej genómovej hybridizácie s vyšším rozlíšením (HR-CGH) a array-CGH pri vyšetrovaní nebalansovaných chromozómových zmien v súbore pacientov Oddělení lékařské genetiky FN Brno. V priebehu roku 2004 sme v spolupráci s firmou Laboratory Imaging s r.o., Praha ako prvé pracovisko v Českej republike vyvinuli metódu HR-CGH. V rámci štúdií klinickej genetiky sme skúmali rozlišovaciu schopnosť tejto metódy u mikrodelečných syndrómov a následne ju stanovili na 4 Mb. Testovali sme aj schopnosť HR-CGH zachytiť chromozómové aberácie v nižšom než 50 % bunkovom zastúpení, a to overovaním získaných výsledkov pomocou I-FISH a sériou testov riedenia DNA od pacientov s presne definovanými aberáciami. V oboch prípadoch sa podarilo preukázať schopnosť HR-CGH odhaliť chromozómové aberácie už pri 20-30 % klonálnom zastúpení aberantných buniek. Následne bola metóda HR-CGH využitá k identifikácii klonálnych aberácii v praxi. V rámci štúdia vrodených chromozómových abnormalít sme sa zamerali na vyšetrenie pacientov s psychomotorickou retardáciou a faciálnou dysmorfiou. Získané chromozómové aberácie boli analyzované hlavne u skupiny pacientov s multiformným glioblastómom, s mnohopočetným myelómom a u skupiny detských pacientov s akútnou leukémiou. Vo všetkých prípadoch zachytila HR-CGH nielen vyšší počet zmien genetického materiálu, ale aj klony s nižším než 50 % zastúpením, čím prispela k presnejšej genetickej charakterizácii a stratifikácii týchto malígnych ochorení. Postupne sme testovali a zavádzali aj metódu array-CGH, ktorá predstavuje najnovšie zdokonalenie techniky CGH. Používali sme čipy založené ako na BAC klonoch (Abbott Molecular Inc.), tak aj na oligonukleotidoch (Agilent Technologies). Vyšetrenia prvých pacientov ukázali, že array-CGH umožňuje nielen spresnenie rozsahu genetických zmien, ale aj identifikáciu jednotlivých génov zahrnutých v nadbytočných a deletovaných oblastiach.

Keywords

chromozómové aberácie, komparatívna genómová hybridizácia (CGH), komparatívna genómová hybridizácia s vyšším rozlíšením (HR-CGH), array-CGH, molekulárna cytogenetika, chromosomal aberrations, comparative genomic hybridization (CGH), high reslution comparative genomic hybridization (HR-CGH), molecular cytogenetics

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 6. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 13. 6. 2008
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Vladimír Ferák, DrSc., prof. RNDr. Marie Jarošová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / General and Molecular Genetics