Regulace alternativniho splicingu

Bc. Pavel Horák

Master's thesis

Regulation of alternative splicing

Anotácia:

Alternativní sestřih pre-mRNA je jedním z nejdůležitějších prvků exprese genů eukaryot. Dovoluje vytvořit více proteinových izoforem z jedné pre-mRNA. Tento proces je proto pečlivě regulován komplexní sítí proteinových interakcí, které zajišťují přesné vynětí intronů. Avšak genetické mutace vnášejí nerovnováhu do této regulace a často vedou k závažným onemocněním. Chybný sestřih exonu 9 pre-mRNA proteinu kódujícího transmembránový vodivostní regulátor (CFTR) vede k tvorbě nefunkčního chloridového kanálu. Tento jev se manifestuje jako závažné formy onemocnění cystická fibróza. Nepřesný sestřih je primárně závislý na sekvenci obsažené v polymorfickém (TG)mTn lokusu situovaném mezi bodem větvení a 3’ sestřihovým místem exonu 9. Na prodlouženou (UG) repetici v transkribované pre mRNA se váže TDP-43, což, za spolupráce s dalšími sestřihovými faktory, jako například hnRNP A1, zabraňuje rozeznání 3’ sestřihového místa standardními sestřihovými faktory a vede k přeskočení exonu 9 a produkci nefunkčního kanálu. V této práci zkoumám interakci nejprve pouze vazebné domény 2 (RRM 2) hnRNP A1 a následně vazebných domén 1 a 2 (RRM 1+2) hnRNP A1 s UP1 RNA – sekvencí RNA, která se nachází na 3’ sestřihovém místě exonu 9 CFTR genu. Tato interakce byla zkoumána separačními (gelová filtrace, elektroforetická analýza změny mobility) a vazebnými (izotermální titrační kalorimetrie) metodami za účelem zjištění její stechiometrie a jejího termodynamického profilu. RRM2 i RRM 1+2 se váží k UP1 RNA v poměru 2:1. RRM 1+2 však interaguje s větší afinitou (Kd je 1.7 µM, ve srovnání s 3.1 µM RRM-2), což naznačuje vzájemnou souhru (s největší pravděpodobností zajištěnou RRM-1) mezi vázajícími se proteiny, která napomáhá formování komplexu. Toto je zajímavé zjištění, které poslouží jako základ pro následné strukturní studie a pomůže pochopit podstatu mechanismu formace komplexu TDP-43 s hnRNP A1, který vede k přeskakování exonu 9 CFTR genu.

Abstract:

Alternative pre-mRNA splicing is a crucial element of eukaryotic gene expression. It allows to create multiple protein isoforms from one pre-mRNA. This process is tightly regulated by a complex network of interactions that facilitate the precise execution of introns removal. Genetic mutations, however, introduce a factor of imbalance to this regulation and often lead to disease. Aberrant splicing of exon 9 of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) pre-mRNA leads to the production of a non-functional chloride channel. This event is associated with severe forms of cystic fibrosis. The unfavourable splicing depends primarily on the composition of the polymorphic (TG)mTn locus between the branch point and the 3’ splice site of exon 9. The (UG)-rich pre-mRNA sequence is targeted by TDP-43, and this, in concert with other splicing factors – like hnRNP A1, prevents the recognition of the 3′ss of exon 9 by the canonical splicing factors and generates non-functional chloride channel. In this thesis I study the interaction of hnRNP A1 RRM-2 and hnRNP A1 RRM-1 + RRM-2 with UP1 RNA – CFTR’s 3’ splice site of exon 9. This interaction was examined using separating (size exclusion chromatography, electrophoretic mobility shift assay) and binding (isothermal titration calorimetry) studies in order to determine its stoichiometry and deliver its complete thermodynamic profile. Both hnRNP A1 RRM-2 and hnRNP A1 RRM-1 + RRM-2 bind to the UP1 RNA in a 2:1 ratio. hnRNP A1 RRM-1 + RRM-2, however, interacts with lower Kd (1.7 µM, compared to 3.1 µM of RRM-2) suggesting that an interplay (most likely facilitated by RRM 1s) between the two copies of protein favours the formation of the complex. This is an exciting result that will provide foundations for further structural studies and help understanding of the mechanisms underlying the formation of the interfering TDP-43 – hnRNP A1 complex at the 3’ splice site of CFTR’s exon 9.

Keywords

cystická fibróza, alternativní splicing, exon, intron, regulace, hnRNP A1, cystic fibrosis, alternative splicing, regulation

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 6. 2016
• Vedúci: Mgr. PharmDr. Peter Lukavsky, Dr. rer. nat.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biomolecular Chemistry