Porovnání kompozice terminálních sacharidů zony pellucidy u prepubertálních a pohlavně dospělých prasnic

Bc. Semen Stepanov

Master's thesis

Comparison of terminal carbohydrate composition of the zona pellucida in prepubertal and sexually mature sows

Abstract:

Zona pellucida (ZP) je důležitá extracelulární glykoproteinová vrstva, která obklopuje oocyt savců a plní významné role v procesech oogeneze, oplození a časného embryonálního vývoje. Díky svému uspořádání a struktuře je mimo jiné zapojena i do druhově specifické interakce mezi spermií a vajíčkem. Klíčovou roli zde hrají především její posttranslační modifikace, mezi které patří i četné glykosylace. Právě unikátní skladba sacharidů v řetězci glykoproteinů je s největší pravděpodobností zodpovědná za tuto druhově specifickou interakci spermie s vajíčkem. Přesné mechanizmy však nejsou u prasečího modelu dostatečně objasněny. Není také známo v jaké fázi vývoje oocytu dochází ke vzniku konečné podoby glykosylačního vzoru na zoně pellucidě prasečích oocytů. Pro svou snažší dostupnost jsou pro experimenty reprodukčních biotechnologií častěji využívány oocyty získané z vaječníků prepubertálních prasnic. Ty však nemusejí ještě nést konečný vzor glykosylací na své zoně pellucidě. Velmi významným momentem může být v této souvislosti zapojení pohlavních hormonů (luteinizačního a folikulostimulačního), jejichž hladiny se cyklicky zvyšují až s nástupem pohlavní dospělosti. Zda je rozdíl ve vzoru glykosylací glykoproteinů zony pellucidy oocytů získaných z prepubertálních nebo z pohlavně dospělých prasnic není doposud detailně popsáno. Cílem této diplomové práce bylo ověřit hypotézu, že kompozice terminálních sacharidů zony pellucidy oocytů se mezi prepubertálními a pohlavně dospělými prasnicemi liší. K ověření této hypotézy byly provedeny tři experimenty, které byly zaměřeny na detekci vybraných sacharidových struktur, konkrétně na detekci kyseliny sialové, N-acetylglukosaminu (GlcNAc) a manózy, u kterých se předpokládá jejich zapojení v druhově specifické vazbě spermie na vajíčko, a to pomocí vhodně zvolených lektinů: WGA k detekci kyseliny sialové, sWGA k detekci N-acetylglukosaminu (GlcNAc) a GNL k detekci manózy. Realizovanými experimenty se nepodařilo ověřit naši hypotézu. Nebyl pozorován statisticky významný rozdíl v relativní intenzitě signálu ani u jednoho ze zvolených lektinů (WGA, sWGA a GNL) mezi skupinou oocytů získanou z vaječníků prepubertálních prasnic a skupinou oocytů získaných z vaječníků pohlavně dospělých prasnic. Kompletní posttranslační modifikace glykoproteinů zona pellucida tedy pravděpodobně probíhají již v růstové fázi oocytu a nástup činnosti pohlavních hormonů v období puberty prasnice není do tohoto procesu zapojen. Bylo by ještě vhodné doplnit získané výsledky sledováním přítomnosti a aktivity konkrétních enzymů, které se na těchto modifikacích podílejí (například neuraminidázy a různých transferáz).

Abstract:

The zona pellucida (ZP) is an important extracellular glycoprotein layer that surrounds the mammalian oocyte and plays a significant role in the processes of oogenesis, fertilization, and early embryonic development. Due to its specific arrangement and structure, it is also involved in species-specific interactions between the sperm and the oocyte. A key factor in this interaction is the set of post-translational modifications of ZP glycoproteins, particularly their extensive glycosylation. The unique composition of carbohydrate moieties on the glycoprotein chains is most likely responsible for the species-specific sperm–oocyte binding. However, the precise mechanisms underlying these interactions remain unclear in the porcine model. Furthermore, it is not yet known at which stage of oocyte development the final glycosylation pattern of the zona pellucida is established in pig oocytes. Due to their easier availability, oocytes from prepubertal gilts are more commonly used in experiments involving reproductive biotechnologies. However, these oocytes may not yet carry the final glycosylation pattern on their zona pellucida. The involvement of sex hormones—luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH)—which rise cyclically with the onset of sexual maturity, may be of particular importance in this context. To date, it has not been clearly described whether there is a difference in the glycosylation pattern of zona pellucida glycoproteins between oocytes obtained from prepubertal and sexually mature pigs. The aim of this diploma thesis was to test the hypothesis that the composition of terminal carbohydrates in the zona pellucida of oocytes differs between prepubertal and sexually mature gilts. To verify this hypothesis, three experiments were carried out focusing on the detection of selected carbohydrate structures—specifically sialic acid, N-acetylglucosamine (GlcNAc), and mannose—believed to be involved in species-specific sperm–oocyte recognition. The detection was performed using specific lectins: WGA for sialic acid, sWGA for N-acetylglucosamine (GlcNAc), and GNL for mannose. The conducted experiments did not confirm our hypothesis. No statistically significant differences were observed in the relative signal intensity of any of the selected lectins (WGA, sWGA, and GNL) between the group of oocytes obtained from prepubertal ovaries and those from sexually mature pigs. This suggests that the complete post-translational modification of zona pellucida glycoproteins likely occurs during the oocyte growth phase, and that the hormonal changes associated with puberty do not play a critical role in this process. To further support these findings, it would be beneficial to investigate the presence and activity of specific enzymes involved in these modifications—such as neuraminidases and various transferases.

Keywords

glykoproteiny, lektiny, oocyt, oogeneze, prase, zona pellucida

Keywords

oogenesis, porcine, glykans, lectins, oocyte, zona pellucida

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2025

Thesis defence

• Date of defence: 20. 5. 2025
• Supervisor: Mgr. Ing. Tereza Krejčová, Ph.D.
• Reader: Marta Homutová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology