Vývoj bioaktivních nosičů pro pokročilou diagnostiku Alzheimerovy choroby

Bc. Marie Vajrychová

Diplomová práce

Development of bioactive carriers for advanced diagnostic of Alzheimer´s disease

Anotace:

V diplomové práci jsme ověřovali účinnost vazby nespecifického IgG izolované z lidského séra, specifických polyklonálních anti?ovalbuminových protilátek na SiMAG/PGL a SiMAG?IDA/Co3+ mikročástice. Získané poznatky jsme uplatnili při imobilizaci monoklonálních specifických protilátek proti A? peptidům (38 ? 42 aminokyselin) a lidskému tau proteinu na SiMAG/PGL a SiMAG?IDA/Co3+ mikročástice. Účinnost vazby jsme hodnotili metodou SDS?PAGE. Zároveň jsme také hledali optimální podmínky pro imobilizaci protilátek na vybrané nosiče, tj. doba a teplota imobilizace. Ověřovali jsme také vliv stáří protilátky na vazbu na mikročástice. U nespecifického IgG jsme ověřovali čistotu a molekulovou hmotnost deklarovanou výrobcem. U specifických polyklonálních a monoklonálních protilátek jsme účinnost vazby na mikročástice ověřovali také izolací antigenu pomocí připravených imunosorbentů a jeho následného uvolnění z vazby kyselou elucí. Kontrolu úspěšnosti izolace jsme prováděli pomocí metod SDS?PAGE a Tris/tricin Urea SDS?PAGE. Na vybrané nosiče SiMAG/PGL a SiMAG?IDA/Co3+ jsme imobilizovali také kinázy, které hrají významnou roli v patogenezi Alzheimerovy choroby, kinázu GSK?3 (GSK?3? His Tag) a MAP kinázu. Aktivitu vázaných kináz jsme ověřovali fosforylací nízkomolekulárních substrátů specifických pro dané kinázy. Ověřovali jsme nový substrát pro GSK?3, neboť standardně pouţívaný CREB peptid se jiţ nevyrábí. Detekci fosforylace jsme prováděli MS analýzou MALDI/TOF/TOF. Kinázu GSK?3 a MAP kinázu jsme pouţili pro fosforylaci lidského tau proteinu. Nejprve jsme tau protein fosforylovali solubilní MAP kinázou a následně solubilní a vázanou GSK?3 (GSK?3? His Tag). Ve výsledných MS spektrech jsme sledovali moţná fosforylační místa tau proteinu.

Abstract:

We verified an efficiency of immobilization human serum IgG, specific polyclonal anti?ovalbumin antibodies to SiMAG/PGL and SiMAG?IDA/Co3+ carriers. We performed immobilization of specific monoclonal antibodies against ? amyloid and human tau protein on SiMAG/PGL and SiMAG?IDA/Co3+ microparticles based on theoretical and practical experience. The efficiency of binding we evaluated by SDS?PAGE method. Currently we found optimal conditions of immobilization antibodies on selected carriers, time and temperature. We verified an influence of the age of antibody solution to the immobilization efficiency. We judged purity and molecular weight of nonspecific IgG proclaimed by producer. We checked the binding capacity of prepared carriers by antigen capturing. We evaluated the antigen capturing efficiency by SDS?PAGE and Tris/tricin Urea SDS?PAGE method. We immobilized enzymes kinases on SiMAG/PGL and SiMAG?IDA/Co3+ carriers. We elected GSK?3 kinase (GSK?3? His Tag) and MAP kinase because of significant role in Alzheimer disease. We evaluated the activity of immobilized kinases by phosphorylation of low molecular specific substrate. We verified new GSK?3 substrate because of no provided CREB peptide as specific substrate for GSK-3 on the market. We estimated the level of phosphorylation by mass spectrometry MALDI/TOF/TOF. We applied selected kinases for tau protein phosphorylation. At first we perform phosphorylation by soluble MAP kinase and then by soluble and immobilized GSK?3 kinase. In the agreement with theoretical potential phosphorylation sites we confirmed the phosphorylation of tau protein.

Klíčová slova

Alzheimerova choroba, beta amyloid, tau protein, fosforylace, kináza GSK?3, MAP kináza, biomarker

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 1. 6. 2011
• Vedoucí: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů