Příprava specifického imunosorbentu pro průkaz A\recke{beta} peptidů, markerů Alzheimerovy choroby

Bc. Martin Komárek

Master's thesis

Development of immunosorbent for A\recke{beta} peptides analysis, markers of Alzheimer disease

Abstract:

Cílem diplomové práce byla příprava specifického imonosorbentu a optimalizace podmínek pro izolaci, průkaz a detekci A\recke{beta} peptidů, markerů Alzheimerovy choroby. Koncentrace A\recke{beta} peptidů různých délek řetězců přímo koreluje s tvorbou amyloidových plátů, jejichž kumulace je sledována při progresi onemocnění a postupném zhoršování kognitivních funkcí nemocných. Pro optimalizaci podmínek izolace byl vybrán modelový systém křenová peroxidasa (Horseradish Peroxidase-HRP) a anti-HRP (polyklonální protilátky proti HRP). Zkoumána byla vazba protilátek na makroporézní nosič perlové celulózy, podmínky vazby a eluce antigenu na imunosorbent a zároveň optimální molární poměr mezi antigenem a protilátkou vedoucí k tvorbě imunokomplexu. K posouzení vlivu prostředí na tvorbu imunokomplexu byly použity techniky imunoturbidimetrie a ELISA test, získané informace byly aplikovány v kolonovém uspořádání metodou nízkotlaké kapalinové chromatografie. Z důvodu optimalizace vazebných a elučních podmínek byla na připravených imunosorbentech pro izolaci A? peptidů provedena řada srovnání. U použitých magnetických nosičů s různými funkčními skupinami byla porovnána účinnost vazby protilátek. K určení množství navázaných protilátek bylo použito několik způsobů: srovnání absorbance vazebného roztoku protilátek před a po imobilizací, stanovení množství protilátek ve vazebných frakcích pomocí BCA testu respektive kontrola množství protilátek technikou SDS-PAGE. Jako nejvhodnější nosič k izolaci A? peptidů byl vybrán SiMAG-hydrazide, na který byly imobilizovány králičí anti-A? IgG specificky orientované na aminokyselinový úsek 1-14 lidského A? peptidu. S připraveným imunosorbentem byly provedeny izolace A? peptidů, množství izolovaných A? peptidů bylo kvantifikováno technikami Tricine-SDS-PAGE a ELISA testem.

Abstract:

The main target of this diplom work was to prepare of a specific imunosorbent and optimalization conditions for isolation, provement and detection of A\recke{beta} peptide, markers of Alzheimer´s disease. Concentration of A\recke{beta} peptide with a different lenght of chain directly correlate with production of amyloid plaques, whose cumulation is seen during progression of disease which is followed by decreaning of cognitive abilities of patiens. Model system Horseradish Peroxidase (HRP) and anti-HRP (polyclonal antibody) were chosen to optimalization conditions for isolation. The antibody binding was inquire into macrofloat sorbent pearl celulose, study was about optimal molar ratio between antigen and antibody leading to creation imunocomplex. For judging of influence of environs on production of imunocomplex was used technique imunoturbidimetry and ELISA test, obtained information was aplicated in colon form by using a metode of low-press fluid chromatography. Due to optimalization of couplant and elution conditions were done many comparations of imunosorbents prepared for isolation A? peptides. Effectivity of binding antibody to magnetic sorbent with different functional groups was compared. Several ways to quantification amount of binding antibody was aplicated: comparation of absorbance binding fraction antibody before and after imobilization, declaration quantity of antibody in binding fraction by using BCA test and check-up of amount antibody by using SDS-PAGE technique. As the most proper sorbent for isolation A? peptides was chosen SiMAG-hydrazide, on which were imobilased rabbit anti-A? IgG specific orientated on aminoacid part 1-14 of human A? peptide. With prepared imunosorbent was made isolations A? peptides, quantity of isolated A? peptides was quantificated by techniques Tricine-SDS-PAGE and ELISA test.

Keywords

Alzheimerova choroba, kumulace, A\recke{beta} peptidy, HRP, imobilizace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 2. 6. 2008
• Supervisor: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / field:
Special Chemical and Biological Programmes / Analysis of Biological Materials