Identifikace genů podílejících se na opravách toxických DNA - proteinových vazeb u huseníčku rolního

Mgr. Klára PROCHÁZKOVÁ

Doctoral thesis

Identification of genes involved in repair of toxic DNA-protein crosslinks in Arabidopsis thaliana

Abstract:

The DNA damage repair (DDR) pathways are critical for genome stability maintenance and, thus, cell viability in living organisms. They have evolved as mending mechanisms to counter the detrimental lesions in cellular DNA resulting from internal or external factors. If not repaired, DNA damage may represent a potential source of cellular stress, mutation, or even cell lethality. To this day, little is understood about a specific type of DNA damage known as DNA-protein crosslinks (DPCs) and its repair. DPCs arise when protein becomes covalently trapped on DNA, consequently representing a physical barrier for DNA metabolic processes such as replication or transcription. This thesis aims to understand the DNA-damaging effects of the structural analog of cytidine, called zebularine, and to reconstruct the repair pathway induced by it. Although zebularine is mainly considered a DNA demethylating agent, its DNA-damaging effects were already discussed decades ago. Still, they were neglected for a long time in the plant field. In bacteria and human cells, zebularine was implied to induce enzymatic DPCs, i.e., crosslinks with one particular enzyme. So far, in plants, zebularine has been proven to cause DNA damage sensed by ATM and ATR kinases and repaired by the SMC5/6 complex (Liu et al., 2015; Nowicka et al., 2020). Firstly, we aimed to uncover the character of DNA lesions induced by this agent and potentially confirm the hypothesis of DPC induction in Arabidopsis. Using a forward-directed suppressor genetic screen in the zebularine-hypersensitive mutant background, we isolated three complementation groups of ZEBULARINE RESISTANT smc6b (ZRS) suppressor mutants zrs1, zrs2, and zrs4. These candidates were identified as mutants in nucleoside transporter ENT3, chromatin remodeler DDM1, and DNA methyltransferase MET1, respectively. Within the framework of this thesis, we further validated and characterized the identified mutants. Showing the genetic, cytological, and biochemical data, we demonstrated that MET1 is a genetic component of zebularine-induced DNA lesion via establishing an enzymatic DPC. Secondly, we intended to reveal the molecular mechanism of the DPC repair induced by zebularine in plants. Therefore, we started another forward-directed genetic screen focusing on the sensitive phenotype to zebularine in Arabidopsis. The next task of this thesis was to single out candidate plants sensitive to zebularine in the mutagenized population, validate their progeny, and process them into the mapping populations. The candidate DPC repair genes were identified using the mapping-by-sequencing approach on selected mapping populations. We chose genes coding subunits of the condensin II multiprotein complex from all identified candidates for further characterization of their DDR phenotypes and role in the repair of zebularine-induced DPCs.

Abstract:

Opravné dráhy poškozené DNA (angl. DNA damage repair; DDR) jsou zásadní pro udržení stability genomu, a tedy i pro životaschopnost buňky živých organismů. Tyto procesy se vyvinuly s cílem působit proti škodlivým lézím, které vznikají v buněčné DNA působením vnějších i vnitřních faktorů. Nejsou-li poškození DNA řádně opravena, představují potenciální zdroj buněčného stresu, mutací nebo, v nejzazším případě, indukují buněčnou smrt. Relativně málo prozkoumaný je však konkrétní typ léze známý jako DNA-proteinová vazba (angl. DNA-protein crosslink; DPC), včetně její opravné dráhy. DPC vzniká v situaci, kdy je protein zachycen na DNA a vytvoří s ní stabilní kovalentní vazbu. Proto DPC představuje fyzikální bariéru pro metabolické procesy probíhající na DNA jako je např. replikace či transkripce. Tato práce si klade za cíl porozumět škodlivým účinkům cytidinového analogu známého jako zebularin a odhalit jím indukovanou reparační dráhu. Ačkoliv byl zebularin dlouho považován za činidlo demetylující DNA, následky jeho působení poškozující DNA byly diskutovány již před mnoha lety. Tyto účinky však byly u rostlin řadu let opomíjeny. Studie provedené na bakteriích a lidských buňkách ukázaly, že by zebularin mohl způsobovat enzymatický DPC, tj. DNA-proteinovou vazbu s konkrétním enzymem. U huseníčku rolního bylo prozatím prokázáno, že zebularin vyvolává poškození DNA, které je detekováno ATM a ATR kinasou a opraveno specifickým faktorem SMC5/6 (Liu et al., 2015; Nowicka et al., 2020). Naším prvním cílem byla charakterizace poškození DNA způsobeného touto chemikálií a případné potvrzení hypotézy o indukci DPC u huseníčku rolního. K tomu jsme využili dopředný supresorový genetický skrín v mutantním pozadí, které vykazuje hypersensitivní fenotyp vůči zebularinu. V rámci skrínu nazvaného "ZEBULARINE RESISTANT smc6b (ZRS)" byly vyizolovány tři komplementační skupiny zrs1, zrs2 a zrs4. U zmíněných skupin pak byly postupně identifikovány mutace v genech pro nukleosidový přenašeč ENT3, modulátor chromatinu DDM1 a DNA methyltransferasu MET1. V této práci jsme identifikované mutanty potvrdili a dále charakterizovali. Dále s využitím genetických, cytologických a biochemických dat jsme ukázali, že MET1 je skutečně částí DNA léze indukované zebularinem prostřednictvím vzniku enzymatického DPC. V další části jsme pak zamýšleli odhalit molekulární mechanismus opravy DNA-proteinové vazby indukované zebularinem u rostlin. Z toho důvodu byl připraven další dopředný skrín zaměřený na sensitivní fenotyp vůči zebularinu u huseníčku rolního. Následujícím cílem této práce tak bylo provést selekci kandidátních rostlin vykazujících sensitivní fenotyp vůči zebularinu v mutagenizované populaci, ověřit fenotyp u jejich potomstva a vytvořit z pravých kandidátů mapovací populace. Z mapovacích populací jsme identifikovali kandidátní geny zapojené do opravy daného poškození pomocí přístupu tzv. mapování sekvenováním. Ze všech zmapovaných kandidátů jsme nakonec vybrali geny kódující podjednotky multiproteinového komplexu, kondenzin II, pro charakterizaci jeho fenotypu v rámci DDR a jeho role v kontextu opravy DPC indukovaného zebularinem.

Keywords

Oprava poškození DNA, zebularin, DNA-proteinová vazba, DNA METHYLTRANSFERASA 1, STRUKTURNÍ ÚDRŽBA CHROMSOMŮ 6B, SMC5/6 komplex, kondensin, Arabidopsis, dopředný genetický skrín, mapování pomocí sekvenování

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 12. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: Mgr. Aleš Pečinka, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology / Molecular and Cell Biology