Cell cycle genes co-expression in multiple myeloma and plasma cell leukemia

Fedor Kryukov, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Úvod: Regulace buněčného cyklu (BC) je dynamický a komplexní proces, který je determinován nejen absolutní hladinou kteréhokoliv z regulátorů buněčného cyklu, ale také celkovou rovnováhou mezi pozitivními a negativními regulátory a jejich vzájemnou souhrou. Cílem předkládané práce bylo popsat koexpresní změny v genech pro regulátory buněčného cyklu u mnohočetného myelomu (MM) a plazmocelulární leukémie (PCL). Materiál a metody: Celkem bylo do studie zahrnuto 7 zdravých dárců (ZD), 104 MM pacientů a 10 pacientů s PCL. Genové expresní profilování (GEP) bylo provedeno na plazmatických buňkách (PCs) pomocí Human Gene 1.0 ST & Human Exon 1.0 ST Arrays. QRT-PCR byla provedena v duplikátech pomocí TaqMan Gene Expression Assays. Proteiny p16 (INK4a) p14 (ARF) byly detekovány pomocí imunoblotingu. Výsledky: Získané výsledky poukazují na přítomnost dynamické expresní rovnováhy mezi souborem aktivátorů a inhibitorů BC. Vzájemné srovnání vzorků PCL, MM a ZD odhalilo koordinované změny v regulaci mitózy a apoptózy/zástavy BC. GEP vzorků MM ukázalo na postižení genů, které se účastní raných fází BC (G1 fáze a G1/S tranzice). U vzorků PCL byly změny v koexpresi genů asociovány s pozdními fázemi BC (G2/M tranzice, S a M fáze) spolu se závažnými změnami ve fázích raných. Ukázali jsme, že exprese CDKN2A je spojena s krátkodobým celkovým přežitím (OS) u nově diagnostikovaných MM pacientů (30,3±3,9 měsíců pro skupinu s nízkou expresí a 7,5±5,6 měsíců pro skupinu s vysokou expresí CDKN2A, p<0,0001). Navíc, u skupiny s nízkou expresí CDKN2A byla prodloužena doba do progrese (TTP) jak u nově diagnostikovaných MM pacientů (20,8±3,6 měsíců pro skupinu s nízkou expresí vs 8,4±2,7 měsíců pro skupinu s vysokou expresí CDKN2A, p<0,0001) tak u celé skupiny MM pacientů (20,8±2,8 měsíců pro skupinu s nízkou expresí vs 9,8±1,1 měsíců pro skupinu s vysokou expresí CDKN2A, p<0,0001). Pomocí imunoblotingu bylo jasně prokázáno, že PCL pacienti mají vyšší hladinu proteinu ARF ve srovnání s MM, zatímco přítomnost INK4a proteinu nebyla nalezena ani u MM ani u PCL pacientů. Závěr: Změny v koexpresi inhibitorů BC lze vysvětlit jako kompanzační reakci k narůstajícímu „onkogennímu stresu“. Toto tvrzení je ve shodě s prognostickým významem CDKN2A, kde pacienti s vyšší expresí tohoto genu mají horší OS a TTP. Navzdory aktivaci kompenzačních mechanismů je celý regulační kompex v nerovnováze z důvodu závažných poruch v regulaci BC během maligní transformace. Konečně, kompexní přenastavení koordinace genů BC během leukémické transformace vytváří základ pro obnovení proliferační aktivity a prolomení mitotického bodu restrikce.

Abstract:

Background: The regulation of cell cycle is dynamic and complex process that is determined not only by the absolute level of any given cell-cycle regulator, but also by the aggregate balance between positive and negative cell-cycle regulators and the interplay among them. The objective of this study was to describe co-expression changes of cell cycle regulatory genes in multiple myeloma (MM) and plasma cell leukemia (PCL). Methods: A total of 7 healthy donors, 104 MM and 10 PCL patients were evaluated for this study. Gene expression profiling (GEP) was performed on plasma cells using Human Gene 1.0 ST & Human Exon 1.0 ST Arrays. qRT-PCR was evaluated in a duplicate reaction using TaqMan Gene Expression Assays. Immunoblotting of p16 (INK4a) and p14 (ARF) proteins was evaluated. Results: Our results highlight presence of dynamic equilibrium between co-expression of activator and inhibitor gene sets. Comparing of PCL, MM and healthy donors revealed coordinated changes in regulation of mitosis and apoptosis/cell cycle arrest. GEP of MM samples revealed affected early phases of cell cycle (G1 phase and G1/S transition). In PCL samples, co-expression changes were associated with late phases of cell cycle (G2/M transition, S and M phase) together with severe alterations in early phases. We have shown that CDKN2A expression is associated with short-term overall survival (OS) in newly diagnosed MM patients (30.3±3.9 months for ‘low’ expressed and 7.5±5.6 months for ‘high’ expressed group, p<0.0001). Moreover, low-expression CDKN2A group showed time-to-progression (TTP) benefit in newly diagnosed patients (20.8±3.6 months for ‘low’ and 8.4±2.7 months for ‘high’ expressed group, p<0.0001) as well as in whole studied cohort of MM patients (20.8±2.8 months for ‘low’ and 9.8±1.1 months for ‘high’ expressed group, p<0.0001). Immunoblotting clearly showed that PCL patients have higher level of ARF protein than MM patients, while level of p16 (INK4a) protein was not determined at all neither in MM nor in PCL patients. Conclusions: Co-expression changes of inhibitors can be explained as a compensatory reaction to growing “oncogenic stress”. This statement is in concordance with prognostic value of CDKN2A, where patients with higher expression of mentioned blocker have worse OS and TTP. Despite compensation mechanisms activation, whole regulatory complex seems to be imbalanced by severe cell cycle dysregulation during malignant transformation. Finally, complex re-setting of cell-cycle gene coordination during leukemic transformation creates background to restore proliferation activity and breakthrough mitotic restriction point.

Keywords

multiple myeloma, plasma cell leukemia, plasma cell, cell cycle genes, CDKN2A, gene expression profiling, gene set differential coordination analysis, mnohočetný myelom, plazmocelulární leukémie, plazmatická buňka, geny buněčného cyklu

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 6. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 12. 9. 2013
• Supervisor: prof. MUDr. Roman Hájek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology