Metabolismus a funkce cytokininů v houbách z řádu Hypocreales a identifikace transportéru auxinu v Claviceps purpurea

Mgr. Josef VRABKA

Doctoral thesis

Production of ergot alkaloid during the interaction of rye plant with fungus Claviceps purpurea

Abstract:

Presented thesis is focused on plant hormones cytokinins and auxins in filamentous fungi from order Hypocreales and consists of four parts. The first part of the work is introduces studied fungal organisms and summarizes current information about the metabolism, transport and signaling of cytokinins and auxins, concurrently describing their role in interaction with microorganisms. The aim of the second part is to study the role of cytokinins in Claviceps purpurea. Response in expression of selected genes involved in cytokinin metabolism in rye host plant (Secale cereale) was followed using quantitative real-time PCR (qPCR), and cytokinin levels were measured at various stages of infection in infected and control plants. Genes with putative function in cytokinin biosynthesis were detected in the C. purpurea genome. Their function was confirmed using heterologous expression in Escherichia coli and subsequent purification by affinity chromatography followed by biochemical characterization. The rate of enzymatic reaction and substrate preference was determined. For further verification, the genes were transformed into Arabidopsis thaliana under the control of constitutive promotor and the change in phenotype was observed. The third part is focused on the expression of de novo cytokinin biosynthesis genes in selected Fusarium species during infection of maize seedlings (Zea mays). At the same time, the change in cytokinin biosynthesis and degradation genes in infected plants was also followed. The last part is devoted to identification of putative auxin transporter in C. purpurea. Deletion mutants were prepared by homologous recombination and auxin levels were determined. Subcellular localization was observed with the GFP fusion protein by fluorescence microscopy. The predicted function was verified by transformation of A. thaliana and subsequent phenotyping of homozygous lines.

Abstract:

Předkládaná disertační práce je zaměřena na rostlinné hormony cytokiny a auxiny u vláknitých hub z řádu Hypocreales a sestává ze čtyř částí. První část práce slouží k seznámení se zkoumanými houbovými organismy a shrnuje současné informace o metabolismu, transportu a signalizaci cytokininů a auxinů, zároveň je popsána jejich role v interakci s mikroorganismy. Cílem druhé části práce je studium role cytokininů u houby Claviceps purpurea. Byla sledována odezva v expresi vybraných genů zapojených do metabolismu cytokininů u hostitelského rostliny žita (Secale cereale) pomocí kvantitativní real-time PCR (qPCR), zároveň byly změřeny hladiny cytokininů v různých fázích infekce u napadených a kontrolních rostlin. V genomu C. purpurea byly odhaleny geny s předpokládaným zapojením do biosyntézy cytokininů. Jejich funkce byla potvrzena heterologní expresí v Escherichia coli, purifikací pomocí afinitní chromatografie a biochemickou charakterizací. Byla stanovena rychlost enzymatické reakce a substrátová preference. Pro další ověření byly geny transformovány do rostlin Arabidopsis thaliana s expresí řízenou konstitutivním promotorem a sledována změna fenotypu. Třetí část je zaměřena na sledování exprese genů de novo biosyntézy cytokininů u vybraných druhů rodu Fusarium během infekce semenáčků kukuřice (Zea mays). Zároveň byla hodnocena i změna exprese genů biosyntézy a degradace cytokininů u napadených rostlin. Poslední část je věnována identifikaci předpokládaného auxinového transportéru u C. purpurea. Homologní rekombinací byli připraveni deleční mutanti, u kterých byly stanoveny hladiny auxinů. Pro určení subcelulární lokalizace bylo využito pozorování fúzního proteinu s GFP pomocí fluorescenční mikroskopie. Pravděpodobná funkce byla ověřena transformací A. thaliana a následnou fenotypizací homozygotních linií.

Keywords

Cytokininy, auxiny, Claviceps, Fusarium, metabolismus, transport

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 4. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2019
• Supervisor: doc. RNDr. Jitka Frébortová, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry