Optimalizace metod analýzy genomické DNA prasat

Bc. Lucie Němcová

Master's thesis

Optimization of methods for analysis of pig genomic DNA

Abstract:

Metodické zpracování diplomové práce je součástí projektu NAZV Č. QK1910217, kdy dílčí část výzkumu je stanovení správné metodiky analýzy genomické DNA prasat pro následné zpracování na SNP technologiích, kde cílem je získání potřebných dat k dalšímu spracování v rámci výzkumu. Výzkum probíhal ve spolupráci Svazu chovatelů prasat, z.s., Výzkumného ústavu živočišné výroby v Uhříněvsi, v.v.i a Českomoravské společnosti chovatelů, a.s.Pro úspěšné stanovení metodiky bylo potřeba stanovit mnoho cílů. Ty se zakládaly na předešlých zkušenostech při sestavování metodiky u skotu. Cíle byly zaměřené na zjednodušení a optimalizování příjmu biologických vzorků do laboratoře, jejich následné zpracování, průběh izolace a následující testace SNP. Zdroj měl laboratoří procházet v tzv. industry modelu, aby mohlo být zpracováno desítky vzorků najednou a nenarušoval se kontinuální provoz laboratoře. Samozřejmě s navýšením průchodnosti vzorků se počítalo i se snížením ceny za vzorek za provedenou izolaci DNA. Současné provádění SNP testace je časově i finančně náročné. Ohled byl brán i na chovatele prasat, aby odběr biologického zdroje byl pro ně vyhovující, nenáročný, jasný a bez komplikací. V neposlední řadě, aby odběr zdroje DNA nenarušoval welfare zvířete.Metodicky bylo stanoveno, že doposud preferovaný odběr krve bude nahrazen jiným, neinvazivním zdrojem DNA. Nabízel se zdroj štětinové cibulky a nasální stěry, které u skotu byly přijaty bez výhrad a u některých chovatelů se nasální stěry staly hlavním posílaným biologickým zdrojem DNA. Pro prasečí štětiny musela být vytvořena adekvátní odběrová sada, vyhovující chodu laboratoře i chovateli prasat.Dále bylo nutné vyzkoušet, které alternativní zdroje bude možné využít v případě, že nebude moci být použito prasečích štětin. Tím se rozumí reziduální zdroje DNA, zmražené krve a spermatické dávky u zvířat již nežijících, ale pro šlechtění a vytvoření genotypizované populace významných. Jednalo se však i o nativní zdroje krve a sperma.Na základě úspěšně provedené vstupní kontroly vzorků DNA, úspěšného stanovení metodiky izolace a určení správné kontroly izolátů DNA, byla provedena testace SNP na PorcineSNP60 v2 BeadChips Illumina. Konečné výsledky v tzv.“call rate“ ukázaly, že izolace DNA a testace SNP technologií proběhla v pořádku ohledně štětinových cibulek, krve a spermatických dávek. Naopak zdroje DNA u nasálních stěrů se ukázaly jako nevyhovující. Metodiku, která probíhala v manuálním procesu bylo možné převést do robotického procesu. Zpracování vzorků přes roboty TECAN FREEDOM EVO A HAMILTON Firefly NIMBUS 96 proběhla v pořádku. Mohlo se dál pokračovat v genotypování vybraných zvířat. Výsledky budou prostřednictvím ČMSCH a SCHP implementovány do chovatelské praxe.

Abstract:

Methodological elaboration of the diploma thesis is a part of the project NAZV No. QK1910217, where a part of the research is to determine the correct methodology of analysis of the genomic DNA of pigs for subsequent processing on SNP technologies. The research was carried out in cooperation with the Association of Pig Breeders, z.s., Research Institute of Animal Production in Uhříněves, v.v.i and the Czech-Moravian Breeders Association, a.s.Many goals had to be set for a successful methodology. These were based on previous experience in compiling the methodology for cattle. The objectives were aimed at simplifying and optimizing the acceptance of biological samples to the laboratory, their subsequent processing, isolation process and subsequent SNP testing. The source had to go through the industry model in the laboratory so that dozens of samples could be processed at the same time and the laboratory's continuous operation would not be interrupted. Of course, increasing the throughput of the samples was also expected to reduce the cost of the sample for DNA isolation. Simultaneous implementation of SNP testing is both time and financially demanding. Consideration was also given to pig farmers, so that the collection of biological resources was convenient for them, unpretentious and without any further complication. Last but not least, the collection of the DNA source does not interfere with the animal's welfare.It has been methodically determined that the previously preferred blood collection shall be replaced by another, non-invasive source of DNA. There was a source of bristly bulbs and popular nasal swabs, which were accepted without reservation in cattle, and for some breeders, nasal swabs became the main biological source of sent DNA. For pig bristles, an adequate collection set had to be created to suit both the laboratory and the pig breeder.It was also necessary to test which alternative sources could be used in case if pig bristles could not be used. This means the residual sources of DNA, such as the frozen blood and sperm doses, in animals which are no longer alive yet exhibit a high importance for breeding and generating a genotyped population. However, these were also native sources of blood and semen.SNP was tested via PorcineSNP60 v2 BeadChips Illumina based on a successfully performed initial check of DNA samples, successful determination of isolation methodology and determination of correct control of DNA isolates. The final results in the so-called “call rate” showed that DNA isolation and SNP testing were all right for the pig bristle, blood and sperm doses. Conversely, the DNA sources in nasal swabs have proved to be unsatisfactory. The methodology used in the manual process could be converted into a robotic process. Sample processing via TECAN FREEDOM EVO and HAMILTON Firefly NIMBUS 96 robots performed well. Genotyping of selected animals may continue.The results will be implemented into the breeding practice throughout ČMSCH and SCHP.

Keywords

Illumina BeadChip, izolace, SNP

Keywords

Illumina BeadChip, izolation, SNP

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Jaroslav Čítek, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Animal Science / Animal Science