Klasifikace zástupců čeledi Bifidobacteriaceae v probiotických a synbiotických preparátech prostřednictvím molekulárně-genetických analýz na základě sekvencí určitých provozních genů

Barbora Holaňová

Diplomová práce

Classification of representatives of the family Bifidobacteriaceae in probiotic and synbiotic supplements using molecular-genetics techniques based on sequences of specific genes

Anotace:

Střevní mikrobiota je tvořena mikroorganismy žijícimi v intestinálním systému lidí a jiných živočichů. Zahrnuje jednak bakterie, ale také další mikroby jako například houby a viry. Mnoho publikovaných studií potvrzuje přímou korelaci střevní mikrobioty a lidského zdraví. Střevní dysbióza je úzce spojována s etiopatogenezí celé řady onemocnění. Složení střevního mikrobiomu není rigidní. Naopak je velmi variabilní a silně utvářeno zevními vlivy. Z tohoto důvodu se zvyšuje zájem o probiotické a synbiotické preparáty. Trh nabízející tyto výrobky se neustále rozšiřuje. Nicméně vědecká komunita poukazuje na to, že komerční pro(syn)biotické preparáty mnohdy neodpovídají výrobcem deklarované kvalitě včetně nesplnění deklarovaných taxonů. Zásadním problémem je absence legislativního opatření pro výrobce komerčních pro(syn)biotických preparátů, která by vyžadovala pravdivě uváděné informace o složení konkrétního výrobku. Mezi důležité probiotické bakterie patří zástupci rodu Bifidobacterium. Rod Bifidobacterium patří do čeledi Bifidobacteriaceae. Jednotliví zástupci bifidobakterií mají své specifické probiotické vlastnosti. Z tohoto důvodu je potřeba, aby výrobcem deklarované taxony v komerčních pro(syn)biotických preparátech, odpovídaly skutečnému složení výrobku. V současné době v zásadě neexistuje metoda, která by umožnila relativně rychlou a přesnou detekci a klasifikaci zástupců čeledi Bifidobacteriaceae ve směsných vzorcích. Z tohoto důvodu bylo cílem této diplomové práce navržení metody, která by umožnila rychle zhodnotit přítomnost deklarovaných taxonů v pro(syn)biotických preparátech. Zástupci čeledi Bifidobacteriaceae obsahují provozní geny, které se liší mezi jednotlivými taxonomickými jednotkami. To umožnilo navržení PCR ,,primerů“ ohraničujících variabilní fragmenty pro čeleď specifického genu, v našem případě genu kódujícího fruktóza-6-fosfát fosfoketolázu. Tyto specificky navržené PCR ,,primery“ byly následně využity pro účely rychlé i laciné detekce a klasifikace zástupců čeledi Bifidobacteriaceae ve směsných, komerčních vzorcích pro(syn)biotik metodou PCR-DGGE. Výsledky navržené molekulárně-genetické metody umožnily relativně snadnou, levnou, rychlou a přesnou detekci a klasifikaci bifidobakterií v pro(syn)biotických preparátech. Metoda byla obzvláště účinná pro detekci Bifidobacterium animalis subsp. lactis. Ovšem nepodařilo se detekovat Bifidobacterium infantis, kterého výrobci mnohdy deklarovali. Shoda mezi našimi výsledky a výrobcem deklarovaným složením byla pouze u 4 z 11 testovaných pro(syn)biotických preparátů. Z toho vyplývá, že námi navržená metoda by mohla pomoci k rychlé detekci bifidobakterií v pro(syn)biotických preparátech a tím ke snadnějšímu ověření kvality těchto výrobků. Výsledky ukazující kvalitu těchto výrobků by pak mohly upozornit na potřebu vzniku legislativního opatření pro výrobce pro(syn)biotických preparátů v souvislosti s pravdivě uváděnými informacemi. Výsledky získané touto metodou by bylo dále vhodné ověřit kultivačními metodami. Stejně tak pokusit se o aplikovatelnost této metody i v jiných směsných vzorcích, u nichž se předpokládá přítomnost bifidobakterií a jiných zástupců čeledi Bifidobacteriaceae.

Abstract:

Gut microbiota consist of microorganisms living in intestinal system of humans and other animals. Dominant part of gut microbiota represents bacteria. The other microorganisms like fungi or viruses create indispensable part of gut microbiota too. Many already published studies confirm direct correlation of gut microbiota with human health. Gut dysbiosis is closely associated with etiopagenesis of many kinds of diseases. The composition of the gut microbiota is not rigid but on the contrary it is very variable and is shaped by working of many extrinsic factors. This is reason why is increasing interest of probiotics and synbiotics supplements. The market providing these products is still widening. However scientific community still point out that these commercial pro(syn)biotics often do not match quality and declared taxons indicated by producer. Essential problem is absence of legislative standards and regulations for producers of commercial pro(syn)biotics which would ask for them truthful showed information about composition of existing product. Members of genus Bifidobacterium belong among important probiotics bacteria. Genus Bifidobacterium belong to family Bifidobacteriaceae. Members of the genus Bifidobacteriae have iťs own specific probiotics characters. This is main reason for need to be taxons declared by producer in line with real composition of product. Nowadays there is not existing method which would enable relatively quick and accurate detection and classification of Bifidobacteriaceae family in mixed samples. That was the reason of my diploma thesis to offer the method which would enable the prompt evaluation of declared taxons presence in commercial pro(syn)biotics. Members of Bifidobacteriaceae family have the housekeeping genes in their genome. But these housekeeping genes have difference among individual taxonomic units. Such vas enabled the proposition PCR “primers” surrounding variable fragments for family of specific gene. In our occasion this was gene encoding fructose-6-phosphate phosphoketolase. These specific offered PCR “primers” was consequently used for purpose of rapid and cheap detection and classification of family Bifidobacteriaceae members in mixed samples of prebiotics and synbiotics by PCR-DGGE method. The results of offered molecular-genetics technique made possible relatively easy, cheap, rapid, accurate detection and classification of Bifidobacteriaceae family members in commercial pro(syn)biotics. We were not successful in detection of Bifidobacterium infantis declared often by producers as a part of commercial probiotics, yet.The match between our results and by producer declared composition was only in 4 from 11 tested pro(syn)biotics preparations. This implies that our designed method would be helpful in rapid detection of Bifidobacteriaceae family members in pro(syn)biotics preparations and such to lead to easier verification of quality of these products. The results showing quality of mentioned products would be the indicator of the need to establish legislative frame for producers of commercial pro(syn)biotics in context of providing of rightful information. In the future there would be suitable if the results obtained by this method are verified by using of cultivation methods. To try to use the application of this method in another mixed samples would be good as well.

Klíčová slova

Bifidobacteriaceae, molekulárně-genetické metody, probiotika, synbiotika, detekce, klasifikace, provozní geny

Keywords

classification, Bifidobacteriaceae, molecular-genetics techniques, housekeeping genes, detection, probiotics, synbiotics

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 4. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Jiří Killer, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program:
Výživa a potraviny