Identifikace proteomických molekulárních cílů molekul s protinádorovým účinkem

Zuzana MACHAČOVÁ

Bachelor's thesis

Identification of Proteomic Molecular Targets of Biologically Active Molecules

Abstract:

Bakalářská práce se věnuje identifikaci proteomických molekulárních cílů molekul s protinádorovým účinkem. Literární přehled je zaměřen na vědní obor proteomiku. v úvodní kapitole jsou popsány její odvětví, přístupy a metody proteomického studia. Další kapitola je věnována způsobům identifikace molekulárních cílů molekul s protinádorovým účinkem. Samostatnou kapitolou práce je také problematika proteinu Ca2+ATPázy sarko/endoplazmatického retikula (SERCA), což je molekulární cíl řady potenciálních protinádorových léčiv. Jedná se o membránovou pumpu sarko/endoplazmatického retikula svalových buněk. Protein transportuje vápenaté ionty z cytosolu do endoplazmatického retikula za současné spotřeby energie z ATP. V průběhu let se ukázalo, že SERCA proteiny hrají významnou roli v homeostáze Ca2+ ve všech savčích buňkách a že jejich inhibice může vést k buněčné smrti. Exprese SERCA proteinu v některých transformovaných buněčných liniích snížena, což znamená, že některé rakovinové buňky jsou k apoptóze zprostředkované Ca2+ náchylnější. Proto je inhibice aktivity SERCA proteinu je využívána v protinádorové terapii. Bylo zjištěno, že jedním z inhibitorů aktivity proteinu je trilobolid, jehož problematice se věnuje poslední kapitola. Experimentální část je zaměřena na metodu afinitní purifikace pro identifikaci molekulárních cílů protinádorových léčiv v buňce. Molekula, jejíž molekulární cíl v buňce chceme identifikovat, je imobilizována na magnetické, případně agarosové, kuličky. Pro navázání molekuly na kuličky byla využita tzv. "click" chemie, tzn. reakce alkynu (na testované molekule) a azidu (na kuličkách) za vzniku velmi stabilního triazolu. Navázaná testovaná molekula byla inkubována s celobuněčným proteinovým lyzátem nádorové linie. Proteiny, které jsou molekulárními cíli, se váží na imobilizovanou molekulu, zbylé proteiny jsou v dalších krocích odmyty a molekulární cíle jsou identifikovány proteomickými metodami.

Abstract:

This bachelor's thesis deals with the identification of proteomic molecular targets of molecules with anticancer effect. The literate review focused on one of the science fields called proteomics. There are described approaches and methods of proteomic study in this chapter. The next chapter is devoted to methods of identifying molecular targets of molecules with anticancer effect. A separate chapter of the work describes the problematics of sarco/endoplasmic Ca2+ATPase (SERCA), which is the molecular target of molecules with anticancer effect. It is a membrane pump of sarcoendoplasmic reticulum of muscle cells. The protein transports calcium ions from the cytosol into the endoplasmic reticulum while consuming energy from the ATP in the same time. Over the years have been shown that SERCA proteins play a significant role in Ca2+ homeostasis in all mammalian cells and their inhibition can cause the death of cells. Reduced SERCA expression in some transformed cell lines means that some cancer cells are more prone to Ca2+ mediated apoptosis. Therefore, inhibition of SERCA protein activity is used in anticancer therapy. It has been found that one of the inhibitors of the protein activity is trilobolide, which problematics is discussed in the last chapter. The experimental part is focused on the method of affinity purification for identification of the molecular targets of antitumor drugs in the cell. A molecule which molecular targets we want to identify in the cell is immobilized on magnetic or agarose beads. The so-called "click chemistry" has been used for the binding of the molecules to the beads. It is the reaction of alkyne (on the tested molecule) and azide (on the beads) to form a very stable triazole. The bounded tested molecule was incubated with the whole cell tumor protein lysate. Proteins, which are molecular targets, bind to an immobilized molecule. Remaining proteins proteins are washed away and molecular targets are identified by proteomic methods.

Keywords

identifikace molekulárních cílů, SDS-PAGE, Western blotting, affinitní purifikace, SILAC, SERCA, trilobolid, thapsigargin

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2019

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Jana Václavková

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology