Receptor pro aromatické uhlovodíky a signální dráhy regulující přežívání a proliferaci normálních a nádorových buněčných populací

Mgr. Jana Svobodová, Ph.D.

Doctoral thesis

The Ah receptor and signaling pathways regulating survival and proliferation of normal and tumor cell populations

Abstract:

Regenerace jater je zprostředkována především pomocí hepatocytů, nicméně k ochraně jater při jejich poškození/selhání může napomáhat i populace dospělých jaterních progenitorových buněk, ze kterých mohou vznikat jak hepatocyty, tak epitelové buňky žlučových cest (cholangiocyty). Předpokládá se, že tato buněčná populace může hrát, zatím ne zcela objasněnou, úlohu i v jaterní karcinogenezi. Řada studií poukázala na to, že tyto buňky mohou být cílem toxických ligandů receptoru pro aromatické uhlovodíky (AhR). Tento ligandem-aktivovaný transkripční faktor je cílem řady vysoce toxických environmentálních polutantů. V této dizertační práci jsou zahrnuty dvě studie, ve kterých jsme se zaměřili na vliv toxického ligandu AhR, 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-p-dioxinu (TCDD), na procesy regulující proliferaci a přežívání potkaního a lidského modelu jaterních progenitorů. Nejprve jsme studovali účinek TCDD na regulaci buněčné smrti (apoptózy) v modelu dospělých jaterních progenitorových buněk potkana, buněčné linii WB-F344, za podmínek uvolnění těchto buněk z kontaktní inhibice buněčné proliferace prostřednictvím TCDD. Stimulace buněčné proliferace v této buněčné linii byla spojena s deregulací exprese řady genů, o nichž je známo, že jsou pod transkripční kontrolou signální dráhy Hippo, významné regulační dráhy kontrolující kontaktní inhibici buněčné proliferace. Hladiny survivinu, známého transkripčního cíle Hippo dráhy, který hraje roli jak během buněčného dělení, tak v inhibici apoptózy, byly výrazně zvýšené v potkaním modelu jaterních progenitorů. Při sledování účinků TCDD na apoptózu indukovanou camptothecinem, genotoxickým inhibitorem topoisomerasy I, bylo zjištěno, že ovlivnění buněk pomocí TCDD před aplikací camptothecinu, vedlo k výraznému posílení apoptózy, a podobných výsledků bylo dosaženo i při použití dalších faktorů poškozujících DNA. Navzdory pozorovanému zvýšení hladiny survivinu tak došlo k posílení apoptózy indukované genotoxickými látkami v jaterních progenitorech potkana. Dále jsme se v práci zaměřili na aplikaci lidského modelu dospělých jaterních progenitorů, buněčné linie HepaRG. Pro studium jsme použili jak intaktní nediferencované HepaRG buňky, tak také buňky, ve kterých jsme (s využitím RNA interference) snížili hladinu efektorů signální dráhy Hippo, YAP1 and TAZ, hlavních regulátorů přežívání a proliferace jaterních buněk. Podobně, jako v potkaním modelu, TCDD posiloval proliferaci v konfluentních lidských jaterních progenitorech, buněčné linii HepaRG. Oproti tomu, v HepaRG buňkách se sníženou hladinou YAP1 a zejména se sníženou expresí YAP1 i TAZ, kde byl pozorován významný nárůst apoptózy, došlo působením TCDD k dalšímu snížení přežívání buněk. To naznačuje, že aktivace AhR může zvyšovat citlivost lidských jaterních progenitorových buněk k působení endogenních apoptických podnětů. Tento předpoklad byl následně potvrzen analýzou vlivu jednoho z ligandů smrti (FasL) na HepaRG buňky. Použitím analýzy DNA microarrays jsme následně zjistili, že TCDD významně ovlivnil expresi řady komponent a/nebo transkripčních cílů signálních drah spojených s regulací chování jaterních progenitorů, jako jsou signální dráhy EGFR, Wnt/β-katenin a TGF-β nebo signální dráha regulující odpověď buněk na inzulin. TCDD výrazně zvyšoval hladinu cytosolického pro-apoptického proteinu BMF (faktor modifikující Bcl2 proteiny) v HepaRG buňkách, což může být spojeno se zvýšenou citlivostí buněk ovlivněných TCDD k apoptóze. Závěrem lze shrnout, že tyto výsledky podporují hypotézu, že na rozdíl od zralých hepatocytů (kde TCDD blokuje buněčnou proliferaci a inhibuje apoptózu), toxické ligan

Abstract:

dy AhR mohou v dospělých jaterních progenitorech jak zvyšovat buněčnou proliferaci, tak posilovat indukci vnitřní i vnější dráhy programované buněčné smrti.

Abstract:

The liver regeneration is primarily mediated by hepatocytes; however, the population of adult liver progenitor cells, which can give rise both to hepatocytes and biliary epithelial cells, may also serve to protect against liver injury/failure. This cell population is also suspected to play yet poorly defined role in liver carcinogenesis. Interestingly, a number of studies indicate that these cells could be targeted by toxic ligands of the aryl hydrocarbon receptor (AhR). This ligand-activated transcription factor is a target of a variety of highly toxic environmental pollutants. In the present thesis, two studies are summarized, where we focused on the impact of toxic AhR ligand, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), on the balance of proliferation and survival processes in rat and human models of liver progenitors. First, we investigated the effects of TCDD on apoptosis regulation in a model of adult liver progenitor cells, rat WB-F344 cell line, during the TCDD-elicited release from contact inhibition. The stimulation of cell proliferation in this cell line was associated with deregulated expression of a number of genes known to be under transcriptional control of the Hippo signaling pathway, a principal regulatory pathway involved in contact inhibition of cell proliferation. Levels of survivin, a known Hippo target, which plays a role both in cell division and inhibition of apoptosis, were significantly up-regulated in rat liver epithelial cell model, as well as in undifferentiated HepaRG cells, representing a human bipotent liver progenitor cell model. When evaluating the effects of TCDD on apoptosis induction by camptothecin, a genotoxic topoisomerase I inhibitor, we observed that the pre-treatment of WB-F344 cells with TCDD significantly increased apoptosis, and similar results were observed also with other DNA-damaging agents. Thus, despite the observed up-regulation of survivin, apoptosis induced by genotoxic insults was potentiated in the model of rat liver progenitor cells. We then continued our work using a human model of adult liver progenitors, HepaRG cell line. We used both intact undifferentiated HepaRG cells and HepaRG cells, where we silenced (through siRNA-mediated knockdown) Hippo pathway effectors, YAP1 and TAZ, principal pro-survival regulators in liver cells. As we observed in rat model, TCDD promoted cell proliferation in confluent control human progenitor HepaRG cells. In contrast, in HepaRG cells with YAP1 and double YAP1/TAZ knockdown, where we observed a significant increase in apoptosis, TCDD further decreased cell survival, thus confirming that the activation of AhR may sensitize human liver progenitors to endogenous apoptotic stimuli. This was confirmed, when we analyzed the impact of death ligand FasL on HepaRG cells. Using microarray analysis, we then observed that TCDD altered expression of a number of constituents and/or transcriptional targets of signaling pathways linked with regulation of progenitor cell behavior, including EGFR, Wnt/β-catenin, TGF-β or response to insulin signaling pathways. TCDD significantly up-regulated cytosolic pro-apoptotic protein BMF (Bcl-2 modifying factor) in HepaRG cells, which could be linked with enhanced sensitivity of TCDD-treated cells to apoptosis. In conclusion, our results seem to support the hypothesis that, in contrast with mature hepatocytes (where TCDD blocks cell proliferation and prevent apoptosis), toxic AhR agonists may increase both cell proliferation and induction of apoptosis elicited by intrinsic or extrinsic apoptotic pathways in adult liver progenitors.

Keywords

AhR, TCDD, jaterní progenitory, Hippo signalizace, Wnt/β-kateninová dráha, proliferace, apoptóza, regenerace jater, liver progenitors, Hippo signaling, Wnt/β-catenin pathway, proliferation, apoptosis, liver regeneration

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 7. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 21. 9. 2018
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D.
• Reader: MVDr. Juraj Kopáček, DrSc., doc. RNDr. Jitka Vostálová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology