Studium vnějších faktorů, které ovlivňují izolaci a stabilitu CD14+ monocytů z periferní krve.

Bc. Adéla FURMANČÍKOVÁ

Master's thesis

Study of external factors that affect the isolation and stability of CD14 + monocytes from peripheral blood.

Abstract:

Lidské CD14+ monocyty jsou složky mononukleárního fagocytárního systému cirkulující v periferní krvi, kde fagocytují a degradují patogenní částice, pozměněné a poškozené buňky a vlastní buňky určené k apoptóze. Mononukleární buňky představují významný diagnostický a prognostický marker řady patofyziologických dějů (zánětlivá reakce, kardiovaskulární onemocnění, nádorová onemocnění).[55] Cílem diplomové práce bylo studium vnějších faktorů, které mohou ovlivňovat úspěšnost izolace CD14+ mononukleárních buněk, jejich čistotu a výtěžek. Metoda je založena na využití centrifugace v hustotním gradientu a následné imunomagnetické separaci monocytů CD14+, která probíhá na koloně s pevnou magnetickou matricí s navázaným antigenem xCD14+. Detekce a kvantifikace výše uvedené subpopulace mononukleárních buněk byla následně provedena metodou průtokové cytometrie, která umožňuje ověření správnosti izolačního postupu. Touto metodikou bylo zpracováno 13 vzorků periferní krve dobrovolníků. [26] Na základě výsledků průtokové cytometrie bylo v laboratoři biochemie PřF OU v Ostravě potvrzeno, že existuje řada faktorů negativně ovlivňující jak průběh, tak výsledek izolace monocytů CD14+. Za významný negativní vnější faktor procesu separace a izolace mononukleárních buněk je vyhodnoceno manuální porušení rozhrání krev-Ficoll, nesprávná technika odběru mononukleárního prstence nebo použití pístu během imunomagnetické separace. Naopak během testování transportní teploty krevních vzorků, či u volby velikosti separační kolony, nebyl zaznamenán žádný zásadní dopad na výsledek izolačního postupu.

Abstract:

Human CD14 + monocytes are members of a mononuclear phagocytic system circulating in peripheral blood, where they phagocyte and degrade pathogenic particles, altered and damaged cells and the cells designated for apoptosis. Along with macrophages and dendritic cells, they represent a significant diagnostic and prognostic marker of many pathophysiological processes (inflammatory reactions, cardiovascular diseases, cancer).[55] The aim of the diploma thesis was the study of the external factors that can influence the success of isolation of CD14 + mononuclear cells, their purity and yield. The method is based on the use of centrifugation in density gradient and subsequent immunomagnetic separation of CD14 + monocytes, which is performed in colony with a fixed magnetic matrix with bound antigen xCD14 +. Detection and quantification of the above-mentioned subpolation of mononuclear cell was subsequently performed by a flow cytometry method, which allows verification of the correctness of the isolation procedure. This methodology was used for processing of 13 samples of peripheral blood obtaine from volunteers. [26] Based on results of flow cytometry, it has been confirmed in the Biochemistry Laboratory of Faculty of Science OU in Ostrava that there are a number of factors that negatively affect the result of the isolation CD14+ monocyte. Important negative external factors for cell isolation of CD14 + monocytes are a manual layer violation of blood-Ficoll, an incorrect technique of mononuclear coil collection or the use of a piston during immunomagnetic separation. On the contrary when the temperature measured during the tranposport to the laboratory or the selection of the size of the separation column was tested there was no significant impact on the result of separation proces.

Keywords

Mononukleární buňky, CD14, gradientová centrifugace, imunomagnetická separace, průtoková cytometrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 1. 2019

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 31. 1. 2019
• Supervisor: Mgr. Michal Haluzík, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology