Genetika populací vážek rodu Leucorrhinia (Odonata)

Mgr. Stanislav OŽANA

Doctoral thesis

Genetics of populations of the genus Leucorrhinia (Odonata)

Abstract:

Dragonflies of the genus, Leucorrhinia (family Libellulidae), are very effective bioindicators of freshwater ecosystems. Many species of this genus are rare, endangered, and/or protected by law in the Czech Republic and throughout Europe. Conventional field methods, such as monitoring of individuals, populations, and species or abundance estimates, and molecular genetic methods using DNA, have been employed to study these species. However, the types of tissues that provide sufficient quantity and quality of DNA, an area that has not been sufficiently investigated in dragonflies, need to be elucidated. Therefore, non-invasive and non-lethal tissue types, exuviae, wing parts, and legs of adults or larvae were compared in model dragonfly species (Leucorrhinia dubia and Anax imperator). Based on the results, exuviae could be a possible source of mitochondrial and nuclear DNA; however, a lower success rate of quality DNA extraction (success rate 56% or 61% depending on the DNA type and dragonfly species) is achieved. The wing and leg parts are sources of very high-quality DNA, and mainly differ in the amount of DNA provided (larger in the legs). Legs, which is the best source of DNA, can be obtained non-lethally from dragonfly larvae, which can regenerate the removed limbs. In cases where a fully non-invasive source of DNA is required, exuviae should be used. When the size and viability of dragonfly populations are being investigated, methods of estimating abundance using capture-recapture surveys and appropriate genetic markers can be suitably combined. We studied a population of L. dubia by transferring 80 individuals to a newly created peatland as part of a conservation translocation, and conducted an in-depth monitoring of this population after 15 years using mark-recapture methods and microsatellite markers. The population was found to be stable and sufficiently abundant after 15 years (estimated at more than 100 individuals). Surprisingly, the population possessed higher genetic variability than the source population. In addition to microsatellites, mitochondrial sequences can be used to obtain information on the genetics of populations and individual species. One of the most popular markers is the DNA barcode, part of the gene for cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) in animals, employed for species determination. However, copies of mitochondrial DNA in the nucleus (NUMTs) pose a problem for population and phylogenetic studies. In L. albifrons and L. dubia, the potential presence and frequency of NUMTs in dragonflies were obtained using classical polymerase chain reaction. Based on the obtained mitogenome of L. albifrons and the analysis of the other two genomes, NUMTs, including the cox1 gene NUMTs, might be frequent in dragonflies. For species identification, using cox1 combined with the gene for NADH dehydrogenase subunit 1 (nad1) or even purely nad1 might be more appropriate for the minimal number of NUMTs of this gene. Thus, NUMTs are a real problem not only for species identification of dragonflies but also for the study of their populations, phylogenetics, and phylogeography. Accordingly, NUMTs can result in incorrect species identification of dragonflies, overestimation of population variability, or incorrect phylogenetic and phylogeographic results. Future studies should consider these nuclear copies of mitochondrial DNA and perform careful assessments of whole mitogenomes to avoid misidentification.

Abstract:

Vážky rodu Leucorrhinia (čeleď Libellulidae) patří mezi velmi dobré bioindikátory sladkovodních ekosystémů. Mnohé z těchto druhů jsou vzácné, ohrožené či chráněné, a to jak na území České republiky, tak i celé Evropy. Pro jejich studium je využíváno jak běžných terénních metod jako sledování jednotlivců, populací i druhů či odhady abundance, tak i molekulárně genetických metod využívajících DNA. Důležité je však vědět, jaké typy tkání poskytují dostatečné množství a kvalitu DNA, což dosud u vážek dostatečně zkoumáno nebylo. V práci proto byly srovnávány u modelových druhů vážek (Leucorrhinia dubia a Anax imperator) neinvazivní a neletální typy tkání, exuvie, části křídel a nohy dospělců či larev. Výsledky ukázaly, že exuvie mohou být zdrojem jak mitochondriální, tak i jaderné DNA, ovšem s nižší úspěšností zisku kvalitní DNA (56 % nebo 61 % v závislosti na typu DNA a druhu vážky). Části křídel a nohy jsou zdrojem velmi kvalitní DNA, lišící se především množstvím poskytující DNA (větší u nohou). Nohy, jako nejlepší zdroj DNA, můžeme neletálně získávat také od larev vážek, které jsou prokazatelně schopny regenerace odebraných končetin. V případech, kdy je třeba zajistit, plně neinvazivní zdroj DNA, by měly být využívány exuvie. Při studiu velikosti a viability populací vážek lze vhodně skloubit metody odhadu abundance pomocí zpětných odchytů a využití analýzy vhodných genetických markerů. V tomto ohledu jsme zkoumali populaci druhu L. dubia, kdy bylo v rámci ochranářské translokace, přeneseno 80 jedinců na nově vzniklé rašeliniště a tato populace byla po 15 letech detailně monitorována jak pomocí metod zpětných odchytů, tak i mikrosatelitových markerů. Analýza ukázala, že populace byla i po 15 letech stabilizovaná a dostatečně početná (dle odhadu více než 100 jedinců) a překvapivě disponovala v porovnání se zdrojovou populací vyšší genetickou variabilitu. Kromě mikrosatelitů můžeme pro zjištění informací o genetice populací a jednotlivých druhů použít také mitochondriální sekvence. Jedním z nejpoužívanějších markerů se tak stal tzv. DNA čárový kód, u živočichů část genu pro podjednotku 1 cytochrom c oxidázy (cox1), využívaný mimo jiné pro druhovou determinaci. Problém pro populační a fylogenetické studie ale představují kopie mitochondriální DNA v jádře (NUMTy). U druhů L. albifrons a L. dubia byly zkoumány pomoci klasické PCR potenciální prezence a frekvence výskytu NUMTů u vážek. Díky získanému mitogenomu L. albifrons a analýze dalších dvou genomů je možné konstatovat, že NUMTy jsou u vážek pravděpodobně časté, a to právě i v případě genu cox1. Pro druhovou identifikace se tak jeví jako vhodnější využití cox1 v kombinaci s genem pro NADH dehydrogenáza podjednotka 1 (nad1) či dokonce čistě jen nad1 s ohledem na minimální množství NUMTů tohoto genu. Naše výsledky tak ukazují, že NUMTy mohou způsobit chybnou druhovou determinaci vážek, nadhodnotit variabilitu populací či vyústit v chybné výsledky fylogenetiky a fylogeografie. Budoucí studie by proto měly zohlednit možnost výskytu jaderné kopie mitochondriální DNA a dobře analyzovat celé mitogenomy, aby nedocházelo k jejich chybné identifikaci.

Keywords

DNA vzorkování, ochranářská genetika, translokace vážek, NUMT, mitogenom, Leucorrhinia dubia, Leucorrhinia albifrons

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 1. 2022

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 25. 2. 2022
• Supervisor: doc. RNDr. Aleš Dolný, Ph.D., doc. RNDr. Aleš Dolný, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Biology