The use of capillary electrophoresis for a study of drug metabolism focused on cytochromes P450 and flavin-containing monooxygenase

Mgr. Jiří Konečný, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Enzymy jsou biomolekuly katalyzující chemické reakce v živých organismech [1,2]. Enzymy určují charakter a rychlost chemické reakce, tvoří harmonickou souhru chemických funkcí živých organismů. Enzymová aktivita může být ovlivněna koncentrací substrátu, teplotou, chemickým okolím (např. pH) a také jinými molekulami, např. aktivátory a inhibitory. Obecně jsou cytochromy membránově vázané hemoproteiny, které obsahují hemové skupiny a podílejí se na elektronovém transportu. Můžeme je nalézt jako monomerní proteiny nebo také jako podjednotky větších enzymatických komplexů, které katalyzují redoxní reakce. Cytochromy můžeme nalézt na vnitřní mitochondriální membráně a endoplazmatickém retikulu eukaryot, v chloroplastech rostlin, fotosyntézu vykonávajících mikroorganismů a bakterií. Cytochromy P450 (CYPy) zahrnují velkou superrodinu proteinů, které jsou hlavními činiteli při detoxifikaci nebo aktivaci obrovského množství cizích hydrofobních látek, včetně mnoha léčiv, chemických karcinogenů a polutantů životního prostředí. Mnoho těchto enzymů je indukovatelných látkami, které metabolizují. Proto jsou CYPy jednou z významných studovaných skupin proteinů na poli výzkumu od toxikologie, přes farmakologii, vědy zabývající se životním prostředím a v neposlední řadě biochemií. Široké spektrum výzkumných metod, které byly a jsou aplikovány na studium CYPů reflektuje rozmanité pozadí mnoha výzkumných projektů na tomto poli výzkumu [3]. Flavinmonooxygenázy (FMOy) představují multigenovou rodinu mikrozomálních enzymů účastnící se metabolismu I. fáze biotransformace, jejíž genové produkty jsou lokalizovány na endoplazmatickém retikulu mnoha tkání. FMO proteinová rodina zahrnuje skupinu enzymů, které katalyzují chemické reakce za účasti vazby flavinového kofaktoru. Obecně FMOy konvertují léčiva, xenobiotika a endogenní látky obsahující měkký nukleofilní heteroatom na více polární molekuly, které jsou poté snadněji vylučovány. Tyto reakce zahrnují oxidaci heteroatomu, zejména nukleofilního atomu, jako je dusík nebo síra, ale také i selen nebo fosfor [4,5]. V zásadě není žádná ideální metoda výzkumu enzymů. Charakter enzymu a důvod studia ovlivňuje výběr vhodné metody výzkumu. Zvolená metoda by měla splňovat mnoho požadavků – měla by být specifická, citlivá, jednoduchá, rychlá a také vyžadovat malé množství enzymu a dalších potřebných chemikálií. Kapilární elektroforéza (CE) je relativně novou účinnou analytickou metodou [6,7]. Od doby uvedení prvního komerčně dostupného přístroje už uplynuly dvě dekády, což přispělo k velkému rozšíření aplikací CE. Dnes je CE univerzálně použitelná metoda, která je vhodná pro separace malých iontů, neutrálních molekul, velkých biomolekul a pro studium fyzikálně-chemických vlastností. CE je používána v různých oblastech jako jsou např. analytická chemie, organická chemie, chemie přírodních produktů, farmaceutický průmysl, chirální separace, molekulární biologie a jiné [8]. Vlastnosti CE jako jsou vysoká účinnost separace, krátký čas analýzy, významně malý injekční objem a možnost různých systémů detekce usnadnily přijetí této technologie. Tato práce demonstruje aplikovatelnost CE, zejména micelární elektrokinetické chromatografie, jako nástroje při studiu enzymů, respektive CYPů a FMOáz. První kapitola začíná obecným úvodem použité techniky, kapilární elektroforézy. Jsou zde vysvětleny základní principy separace, pojmy a rovnice související s CE. Poté následuje krátký úvod k CYPům a FMOázám. Čtvrtá část obsahuje přehledný článek věnovaný aplikacím CE ve studiu metabolismu léčiv. Druhá kapitola obsahuje experimentální poznatky týkající se CYP 2C9 ve vztahu k diklofenaku

Abstract:

, jakožto substrátu. První část této kapitoly je věnována stanovení kinetických parametrů (konstanty Michaelis-Mentenové – Km a maximální rychlosti – Vmax) za použití micelární elektrokinetické chromatografie. Druhá část této kapitoly je zaměřena na stanovení inhibičních účinků na reakci katalyzovanou CYP za použití silného a středně silného inhibitoru sulfafenazolu a ketokonazolu. Třetí kapitola je věnována dalšímu studovanému enzymu – FMO a zároveň elektroforeticky zprostředkované mikroanalýze (Electrophoretically Mediated MicroAnalysis - EMMA), metodě používající částečného plnění kapiláry, která byla použita ke studiu kinetických parametrů, Km a Vmax, ve vztahu ke klozapinu, který byl v tomto experimentálním uspořádání použit jako substrát. Poslední kapitola věnovaná shrnutí a závěrům stručně rekapituluje experimentální část a pojednává o možnostech CE týkajících se studovaných enzymových reakcí. [1] R.H. Garrett, C.M. Grisham (Ed.), Biochemistry, Saunders College Publishing, 1999. [2] A.D. Smith (Ed.), Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997. [3] I.R. Phillips, E.A. Shephard (Ed.), Cytochrome P450 Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998. [4] J.R. Cashman, Chemical Research in Toxicology 8 (1995) 165. [5] J.R. Cashman, J. Zhang, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 46 (2006) 65. [6] D.N. Heigher, High Performance Capillary Electrophoresis, An Introduction, Hewlett-Packard Company, France, 1992. [7] S.F.Y. Li, Capillary electrophoresis, principles, practise and applications, Elsevier Science B.V., Amsterdam, 1993. [8] J.I. Haleem, Electrophoresis 21 (2000) 1921.

Abstract:

Enzymes are biomolecules that catalyze chemical reactions in living organisms [1,2]. Enzymes govern the character and rate of chemical reactions, and form a harmonious conformity of chemical functions in living organisms. Enzyme activity can be affected by the substrate concentration, tepmerature, chemical enviroment (e.g. pH), and also by other molecules, e.g. activators and inhibitors. Cytochromes are, in general, membrane-bound hemoproteins that contain heme groups and carry out electron transport. They are found either as monomeric proteins or as subunits of bigger enzymatic complexes that catalyze redox reactions. Cytochromes are found in the mitochondrial inner membrane and endoplasmic reticulum of eukaryotes, in the chloroplasts of plants, in photosynthetic microorganisms, and in bacteria. Cytochromes P450 (CYPs) comprise a large superfamily of proteins that are in central importance in the detoxification or activation of a tremendous number of foreign hydrophobic compounds, including many therapeutic drugs, chemical carcinogens, and environmental pollutants. Many of these enzymes are inducible by the compounds they metabolize. Consequently, CYPs are one of the most exclusively studied groups of proteins, being investigated by researchers in fields as diverse as toxicology, pharmacology, environmental biology, molecular biology, and last but not least biochemistry. The wide range of techniques that have been applied to CYPs reflects the diverse backgrounds of many research projects active in this field [3]. The flavin-containing monooxygenases (FMOs) represent a multigene family of microsomal enzymes involved in Phase I metabolism whose gene products are localized in the endoplasmic reticulum of many tissues. FMO protein family consists of a group of enzymes that catalyze chemical reactions via the bound cofactor flavin. Generally, FMOs convert drugs, xenobiotics and endogenous compounds containing a soft nucleophilic heteroatom to more polar molecules that are then effortless excreted. These reactions involve oxidation of heteroatoms, particularly nucleophilic atoms such as the nitrogen or sulfur, with fewer examples of a selenium or phosphorous [4,5]. In general, there is no ideal assay for enzyme studies. The nature of an enzyme and the purpose of study affect the choice of an appropriate assay. The selected method should to fulfil many demands – it should be specific, sensitive, simple, rapid and also the requirements on both the enzyme amount and other chemicals should be minimal. Capillary electrophoresis (CE) is a relatively new powerful analytical tool [6,7]. Since the introduction of the first commercial CE instrument was two decades ago, CE applications have become widespread. Today, CE is a versatile analytical technique which is successfully used for the separations of small ions, neutral molecules, and large biomolecules and for the study of physicochemical parameters. It is being utilised in widely different fields, such as analytical chemistry, forensic chemistry, clinical chemistry, organic chemistry, natural products, pharmaceutical industry, chiral separations, molecular biology, and others [8]. Qualities of CE such as high efficiency of separation, short analysis time, remarkably low injection volume and a variety of detection systems have facilitated acceptance of this technology. This work aims to show the applicability of CE, mainly the micellar electrokonetic chromatography, as a tool in studies of enzymes, CYPs and FMO respecively. The first chapter starts with a general introduction of the employed technique, capillary electrophoresis. The basic separation principle is explained, as well as some expressions and equations related to CE separations. Then a short introduction to CYPs and FMOs is presented. Fourth part comprises the review engaged in the application of CE in drug metabolism. In the second chapter, the experimental finding concerning CYP 2C9 in relation to diclofenac as a substrate

Abstract:

are discussed. First part of this chapter deals with the determination of kinetic parameters (Michaelis-Menten constant - Km and maximum reaction velocity – Vmax) using micellar electrokinetic chromatography. Second part of this chapter is focused on the evaluation of inhibitory effects on CYP reaction by use of strong and moderate inhibitor, sulfaphenazole or ketoconazole respectively. Chapter 3 introduces both the next enzyme, FMO, and the Electrophoretically Mediated MicroAnalysis (EMMA) using partial filling technique to study kinetic parameters, Km and Vmax, in the relation to clozapine which was used as a substrate in this experimental set-up. The general summary and conclusions at the end of this dissertation summarize the experimental work and discuss the capabilities of CE regarding integrated enzyme reactions. [1] R.H. Garrett, C.M. Grisham (Ed.), Biochemistry, Saunders College Publishing, 1999. [2] A.D. Smith (Ed.), Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997. [3] I.R. Phillips, E.A. Shephard (Ed.), Cytochrome P450 Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998. [4] J.R. Cashman, Chemical Research in Toxicology 8 (1995) 165. [5] J.R. Cashman, J. Zhang, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 46 (2006) 65. [6] D.N. Heigher, High Performance Capillary Electrophoresis, An Introduction, Hewlett-Packard Company, France, 1992. [7] S.F.Y. Li, Capillary electrophoresis, principles, practise and applications, Elsevier Science B.V., Amsterdam, 1993. [8] J.I. Haleem, Electrophoresis 21 (2000) 1921.

Keywords

Kapilární elektroforéza, MEKC, cytochrom P450, CYP 2C9, metabolismus léčiv, diklofenak, sulfafenazol, ketokonazol, flavin monooxygenáza, FMO, EMMA, klozapin, capillary electrophoresis, cytochrome P450, drug metabolism, diclofenac, sulfaphenazole, ketoconazole, flavin-containing monooxygenase, clozapine

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 1. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 12. 1. 2010
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Juraj Ševčík, Ph.D., doc. Ing. Ivan Mikšík, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry