Využití biokatalytických a elektrokatalytických procesů při elektrochemické detekci hybridizace DNA a dalších biomolekulárních interakcí

Bc. Eva Šimková

Master's thesis

Utilization of biocatalytical and electrocatalytical processes in the electrochemical detection of DNA hybridization and other biomolecular interactions

Anotácia:

Předkládaná diplomová práce se zabývá možnostmi využití enzymových a elektrokatalytických systémů pro vysoce citlivou a specifickou detekci hybridizace DNA nebo jiných biomolekulárních interakcí. Detailní rešerše dostupné literatury diskutuje možnosti analytického využití vlastní elektrochemické aktivity nukleových kyselin i použití různých elektrochemicky aktivních značených sond. Speciální důraz je kladen na využití DNA ligáz v elektrochemické analýze biomolekul. Na základě této rešerše byla vyvinuta nová metoda pro sledování aktivity DNA ligáz. Technika využívá systému dvou krátkých značených oligonukleotidů ve spojení s dvoupovrchovou elektrochemickou detekcí. Detekce produktu ligace je prováděna s pomocí enzymaticky značené monoklonální protilátky, což umožňuje dosáhnout vysoké přesnosti detekce a citlivosti analýzy díky enzymatické amplifikaci signálu. Metoda byla testována sérií optimalizačních pokusů na syntetických oligonukleotidech. Enzymová analýza s elektrochemickou detekcí byla poté úspěšně použita pro sledování aktivity rekombinantních fragmentů bakteriální ligázy LigA. Analytická technika předkládaná touto diplomovou prací může být proto využívána pro sledování aktivity DNA ligáz in vitro.

Abstract:

The diploma thesis presents a detailed bibliographical search of the possibilities of utilization of various enzymatic or electrocatalytical systems for highly specific and sensitive electrochemical detection of DNA hybridization or other biomolecular interactions. Various methods making use of either the intrinsic electroactivity of native molecules or application of a variety of labels bound to a variety of probes are discussed. Utilization of DNA ligases for the electrochemical analysis is emphasized. On the basis of this background research a novel approach to a DNA ligase activity monitoring was developed. The technique based on a system of two short labeled oligodeoxynucleotide probes connected with the double-surfaced electrochemical assay was optimized during various experiments using synthetic oligodeoxynucleotides. The technique makes use of a highly specific detection system based on an enzymatically labeled antibody, thus enabling the signal amplification. Proposed enzyme-linked electrochemical assay was successfully used for the analysis of the nick-joining activity of the recombinant E. coli ligase A fragments and is thus suitable for a ligase activity monitoring in vitro.

Keywords

DNA ligasa, sledování enzymové aktivity, magnetické kuličky, digoxin, elektrochemická analýza, voltametrie, DNA ligase, ligase activity monitoring, magnetic beads, electrochemical analysis, voltammetry

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 6. 2011
• Vedúci: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biomolecular Chemistry