Expresní profilování vybraných imunitních molekul v periprotetické tkáni v okolí asepticky odloučených totálních endoprotéz

Mgr. Tereza DÝŠKOVÁ

Doctoral thesis

Abstract:

Periprotetická osteolýza (PPOL) a aseptické uvolnění (AU) patří mezi nejzávažnější pozdní komplikace totální endoprotézy (TEP) kolena a kyčle. Přestože patomechanismus PPOL/AU není stále popsán, ukazuje se, že klíčovou roli hrají otěrové částice, jež se uvolňují z povrchů kloubních náhrad a stimulují buňky okolních tkání k produkci pro-zánětlivých cytokinů a dalších regulačních molekul, které následně podporují diferenciaci osteoklastů a resorpci kosti. V současné době existují stále omezené informace o molekulách/dráhách, které přispívají k různým stádiím PPOL/AU, zvláště u TEP kolena. V naší studii jsme se tedy zaměřili na vyšetření expresního profilu souboru zánětlivých a osteoklastogenních molekul v periprotetických tkáních v okolí asepticky odloučených TEP kolena a kyčle, a osteoartritid kolena a kyčle. Genový expresní profil byl studován pomocí kvantitativní RT-PCR, k vyšetření proteinové exprese kandidátních molekul pak byla využita imunohistochemie, ELISA a nová technologie "Antibody-based Proximity Extension Assay". Abychom získali více znalostí o individuální predispozici k PPOL/AU, vyšetřili jsme expresní profil zánětlivých cytokinů produkovaných mononukleárními buňkami periferní krve po stimulaci zánětlivým lipopolysacharidem pomocí metody Luminex a ELISA u pacientů se závažnou a mírnou osteolýzou a u podskupin pacientů dle přítomnosti TNF-238*A, alely asociované se závažnou osteolýzou. Při porovnání expresních profilů u TEP kolena a kyčle jsme pozorovali rozdíl v expresi CCL3, chemoatraktantu klíčového při iniciálních stádiích komplikací TEP kolena, a DC-STAMP, důležitého regulátoru fúze buněk a diferenciace osteoklastů do obrovských mnohojaderných buněk, zodpovědných za resorpci kosti. Dále byl na základě našich dat nominován NF-kB jako možný regulátor procesů vedoucích k rozvoji osteolýzy; výraznější role tohoto transkripčního faktoru v časných stádiích aseptické osteolýzy v porovnání s pozdními stádii osteolýzy naznačuje potenciální využití NF-kB jako terapeutického a profylaktického cíle u pacientů s TEP kolena a kyčle. Naše studie také ukázala, že pozdní stádia PPOL/AU u TEP kolena jsou charakterizována vyšší proteinovou expresí některých imunitních molekul, jako jsou Amphiregulin, sTNF-R2, BAFF and Kallikrein-6, ve srovnání s časnou osteolýzou. Dále jsme pozorovali rozdílný cytokinový expresní profil u stimulovaných mononukleárních buněk periferní krve získaných u pacientů s TEP kyčle se závažnou osteolýzou při porovnání s mírnou osteolýzou, a také při porovnání podskupin pacientů dle přítomnosti rizikové TNF-238*A alely. Závěrem tedy můžeme říci, že naše studie ukázala rozdíly v expresních profilech u TEP kolena a kyčle, přičemž byly pozorovány snížené hladiny CCL3 a DC-STAMP u TEP kolena. Dále byl na základě našich dat nominován NF-kB jako možný regulátor časných stádií PPOL/AU, což naznačuje jeho potenciální využití jako terapeutického/profylaktického cíle u pacientů s TEP kolena a kyčle. Naše studie dále ukázala zvýšenou expresi některých imunitních molekul v pozdních stádiích PPOL/AU; tyto molekuly budou jistě předmětem dalšího studování. Navíc jsme pozorovali pozměněný cytokinový expresní profil u pacientů s TEP kyčle se závažnou/mírnou osteolýzou a při porovnání nosičů/nenosičů TNF-238*A alely, asociované se závažnou osteolýzou.

Abstract:

Periprosthetic osteolysis (PPOL) and aseptic loosening (AL) are major long-term complications of total knee (TKA) and hip (THA) arthroplasty. Although the exact pathomechanism of PPOL/AL is still unknown, there is growing body of evidence that the wear particles, deliberating from the implant surface, stimulate the surrounding tissue cells to release pro-inflammatory cytokines and other regulatory factors, which in turn promote osteoclast differentiation and subsequent bone resorption. To date, there is still limited information on the molecules/pathways contributing to various stages of PPOL/AL, especially in TKA. Our study thus aimed to investigate the expression pattern of a comprehensive set of inflammatory and osteoclastogenic molecules in periprosthetic tissues from aseptically loosened TKA, THA, knee and hip osteoarthritis. The gene expression profiles were assessed using quantitative RT-PCR, the protein expression of candidate molecules was assessed using immunohistochemistry, ELISA, and novel Antibody-based Proximity Extension Assay. In order to get more insight into the individual predisposition to PPOL/AL, the cytokine expression pattern of pro-inflammatory cytokines produced by stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was investigated using Luminex and ELISA in patients with various stages of osteolysis and in patient subgroups according to the presence of TNF-238*A, an allele associated with severe osteolysis. When comparing the expression pattern in TKA and THA, we revealed a difference in expression of CCL3, a chemoattractant crucial for the initial stages of TKA complications, and DC-STAMP, a critical regulator of cell-cell fusion and differentiation of osteoclasts into multinucleated giant cells. Comparing tissues from aseptically failed knee and hip arthroplasty, we discovered differences in number, size and number of nuclei in osteoclast-like giant cells, a population responsible for bone resorption. Further, our data nominated NF-kB as possible regulator of processes leading to the development of osteolysis, as shown by more pronounced role in earlier preosteolytic stages of aseptic osteolysis comparing to late osteolytic stages, thus suggesting this transcription factor as a potential therapeutic or prophylactic target for patients with TKA and THA. Our study also showed that late stages of PPOL/AL in TKA are characterized by higher expression of certain immune-related proteins, such as Amphiregulin, sTNF-R2, BAFF and Kallikrein-6, when comparing to early-osteolysis. In addition, the alteration in cytokine-expression pattern was observed in stimulated PBMCs obtained from THA patients with severe osteolysis comparing to mild osteolysis as well as in subgroups of patients according to the presence of a risk TNF-238*A allele. In conclusion, our study revealed different expression profiles in TKA and THA, with decreased levels of CCL3 and DC-STAMP expression in TKA. Moreover, our data nominated NF-kB as possible regulator of early preosteolytic stages of PPOL/AL, suggesting it as a potential therapeutic/prophylactic target for patients with TKA and THA. Further, our study revealed upregulation of certain immune-related proteins in late stages of PPOL/AL, which deserves further investigation. In addition, we reported altered cytokine-expression signature between severe/mild osteolysis and carriers/non-carriers of TNF-238*A, an allele associated with high risk of aseptic osteolysis.

Keywords

totální endoprotéza kolena/kyčle, osteolýza, aseptické uvolnění, expresní profilování, cytokiny, genetická predispozice

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 9. 2015

Zverejniť od: 28. 9. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 2. 12. 2015

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / odbor:
Medical Immunology / Medical Immunology