Biochemická a proteomická analýza signalizace pomocí mitogen-aktivovaných proteinkinas při oxidativním stresu

Mgr. Petr DVOŘÁK

Doctoral thesis

Biochemical and proteomic analysis of mitogen-activated protein kinase signaling during oxidative stress

Abstract:

Mitogen-aktivované protein kinasové (MAPK) kaskády řadíme mezi evolučně vysoce konzervované signalizační dráhy, které hrají důležitou úlohu v řadě buněčných procesů. Jednou z jejich hlavních úloh je přenos signálu přijatého z vnějšího prostředí skrze receptory s nitro- a mezibuněčnou signalizací. Taktéž hrají nezastupitelnou signalizační roli během navazování patogenních nebo symbiotických vztahů mezi rostlinou a mikroorganizmy. V rostlinách vystavených podmínkám působení biotického a abiotického stresu dochází ke značné akumulaci reaktivních forem kyslíku (ROS) způsobujících v buňkách oxidační stres, který v krajních případech může vést až k buněčné smrti. ROS hrají nezastupitelnou roli v buněčné signalizaci a během vývojových procesů rostlin. Zvýšená akumulace ROS aktivuje některé MAPK, které následně regulují řadu buněčných pochodů včetně modulace antioxidační obrany zahrnující superoxiddismutasy (SOD). Předchozí studie naznačují, že enzymatická aktivita a abundance některých SOD je regulována pomocí MAPK v odpovědi na různé stresové podmínky vedoucí k akumulaci ROS. První část této práce se zabývá studiem MAPK při působení oxidačního stresu a jejich zapojením do procesu iniciace symbiotických vztahů s beneficiálními bakteriemi Sinorhizobium meliloti a následné nodulace u rostliny Medicago sativa. Biochemická, fenotypová a proteomická analýza linie M. sativa s cíleně sníženou abundancí MAPK kinasy (SIMKK RNAi linie) odkryly možné zapojení MAPK kaskád do těchto procesů. SIMKK RNAi linie vykazovala snížený počet nodulů v porovnání s divokým typem. Následná biochemická a proteomická analýza ukázala, že tento fenotyp může být způsoben poruchami adheze bakterií na povrch kořenů, remodelace plazmatické membrány a poruchami redox regulace včetně antioxidačních proteinů. Noduly transgenní linie vykazují postižený metabolismus dusíku a uhlíku, jak naznačuje proteomická analýza. Cílem druhé části práce bylo popsat vývojové a lokalizační role SOD isoenzymu (FSD1) v rostlině Arabidopsis thaliana a navrhnout možné mechanismy jeho regulace pomocí MAPK. Zjistili jsme, že FSD1 je zapojena do vývoje laterálních kořenů a má ochrannou roli během indukovaného oxidačního a solného stresu. Pomocí mikroskopické analýzy byla definována subcelulární lokalizace FSD1 v cytoplasmě, chloroplastech a překvapivě i v buněčném jádře. FSD1 má specifickou roli při narušení epidermis během prorůstání radikuly ze semena při klíčení. FSD1 protein byl taktéž akumulován ve vyvíjející se špičce kořenového vlásku. Pomocí ko-imunoprecipitační metody v kombinaci s hmotnostní spektrometrií byli identifikováni potenciální interakční partneři FSD1 a navrženy možné úlohy FSD1. Závěr této části je věnován možnému zapojení MPK3 a MPK6 v regulaci exprese FSD1 skrze SPL transkripční faktory. Se zvyšujícími se potřebami lidstva a současně velmi dynamicky se měnícími environmetálními podmínkami je již v současné době konvenční zemědělství na hranici svých limitů. Pochopení mechanizmů symbiotických vztahů, a to především jeho úvodních signalizačních drah, může vést k novým biotechnologickým aplikacím spojených s možností zvýšení výnosů pícnin, jako je Medicago sativa. Velmi vhodnou variantou je taktéž cílená modifikace antioxidačních enzymů, která by vedla k vyšší rezistenci rostlin jak na biotický, tak především abiotický stres. Pro jejich cílenou modifikaci je však nejprve důležité pochopit veškeré jejich funkční úlohy v rostlinách. Tato práce částečně přispívá k pochopení úlohy MAPK kaskád a FSD1 proteinu v rostlinách a podporuje jejich možné zapojení do biotechnologických aplikací v zemědělství.

Abstract:

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades are evolutionarily highly conserved signaling pathways that play an important role in many cellular processes. One of their main functions is to transmit the signal received from the external environment through receptors by intra- and intercellular signaling. They also play an irreplaceable signaling role during the establishment of pathogenic or symbiotic relationships between the plants and microorganisms. Plant cells exposed to biotic and abiotic stress conditions accumulate reactive oxygen species (ROS) causing oxidative stress, which in extreme cases can lead to cell death. ROS plays a critical role in cell signaling and plant developmental processes. Increased accumulation of ROS activates MAPKs, which in turn regulate several cellular processes, including antioxidant enzymes such as superoxide dismutases (SODs). The main aim of the first part of this thesis is to examine the role of MAPK during the initiation of symbiotic relationships of Medicago sativa with the beneficial bacteria Sinorhizobium meliloti and subsequent nodulation. Biochemical, phenotypic and proteomic analyses of the M. sativa transgenic SIMKK RNAi line with reduced expression of MAPK kinase SIMKK revealed the possible involvement of MAPK cascades in these processes. SIMKK RNAi line displayed a reduced number of nodules compared to the wild type. Subsequent biochemical and proteomic analysis showed that this phenotype could be caused by defects in bacterial adhesion to the root surface, plasma membrane remodeling, and redox regulation, including the abundance of antioxidant proteins. The nodules of the transgenic line show an affected nitrogen and carbon metabolism. Within the second part, the developmental roles and localization of the SOD isoenzyme FSD1 in Arabidopsis thaliana were examined. Moreover, possible mechanisms of its regulation by MAPK were suggested. We found that FSD1 is involved in the development of lateral roots and it has a protective role during oxidative stress and salt stress. FSD1 localizes in the cytoplasm, chloroplasts and, surprisingly, in the nucleus, as revealed by advanced microscopy. It temporarily accumulates at the site of endosperm rupture during seed germination. With the help of co-immunoprecipitation, potential interaction partners of FSD1 were identified by mass spectrometry and possible functions of FSD1 were proposed. Finally, experiments were conducted in order to reveal the possible involvement of MPK3 and MPK6 in the regulation of FSD1 expression through SPL transcription factors. With the increasing demands of humanity and dynamically changing environmental conditions, conventional agriculture is nearing its limitations. The understanding of the symbiotic relationships and especially its initial signaling pathways can lead to subsequent biotechnological advances and thus increase crop yields. A feasible alternative is also a genetic modification of antioxidant enzymes, which would lead to higher resistance of plants to both biotic and abiotic stress. However, for their targeted modification, it is important to understand their functions in plants. This work contributes to the understanding of the role of MAPK cascades and FSD1 protein in plants and supports the claim for their possible involvement in biotechnological applications in agriculture.

Keywords

Arabidopsis thaliana, signalizace, mitogenem aktivované protein kinasy, fosforylace proteinů, reaktivní formy kyslíku, oxidační stres, antioxidační enzymy, superoxiddismutasy, FSD1, rostlinný vývoj, SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE proteins, Sinorhizobium meliloti, nodulace, biotický stres, proteomická analýza

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 3. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2021
• Supervisor: doc. Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biochemistry