Sledování změny fosforylace proteinů kančích spermií během in vitro kapacitace

Bc. Petra Svobodová

Master's thesis

Monitoring the change in phosphorylation of boar sperm proteins during in vitro capacitation

Abstract:

Kapacitace a akrozomální reakce (AR) spermie jsou procesy, které představují velmi dynamické děje nezbytné pro oplození oocytu in vivo nebo in vitro. Během kapacitace dochází k fyziologickým změnám souvisejícím s hyperaktivací pohybu spermie a přípravě spermie na fúzi s vajíčkem. Změny ve spermii jsou řízeny aktivací intracelulárních signalizačních drah, jejichž výsledkem je fosforylace na určitých proteinech. Fosforylace patří k posttranslačním modifikacím proteinů a fosforylace na tyrozinu je považována za jednu z nejdůležitějších modifikací spojenou právě s kapacitací spermií, která vede k interakci spermií se ZP, indukci akrozomální reakce a membránové fúzi. Její hodnocení a objasnění všech mechanizmů, s kterými je spojená, může tedy velmi významně pomoci při pochopení podstaty fertilizace. Cílem práce bylo popsat změny ve fosforylaci proteinů kančích spermií před in vitro kapacitací, během kapacitace a po akrozomální reakci. Hypotéza práce vycházela z předpokladu, že budou detekovány rozdíly v lokalizaci a míře fosforylace proteinů v ejakulovaných a in vitro kapacitovaných spermií a spermií po akrozomální reakci z nativního ejakulátu a inseminační dávky. V této diplomové práci byla hodnocena tyrozinová fosforylace pomocí nepřímé imunofluorescenční mikroskopie u kančích spermií byl prokázán rozdíl v podílu fosforylačních vzorů ve spermiích z nativního ejakulátu a inseminační dávky. U in vitro kapacitovaných spermií převládal fosforylační vzor v oblasti akrozomu, a to především u spermií z inseminační dávky. V žádném z našich experimentů nebyl fosforylován bičík. U části spermií po AR byla zaznamenána fosforylace v přední části hlavičky. Dále byla provedena detekce fosfotyrozinu v proteinových extraktech pomocé metody Western blot u kančích spermií a byly zjištěny výrazně fosforylované proteiny o molekulové hmotnosti 28 kDa, 35 kDa a 41 kDa. V průběhu kapacitace jsme zaznamenali nárůst fosforylace během prvních dvou hodin, poté se množství fosforylovaných proteinů snižovalo. Zajímavé bylo zvyšování míry fosforylace proteinu o molekulové hmotnosti 28 kDa zejména v pozdější fázi kapacitace. U kapacitovaných spermií a spermií po AR byly navíc detekovány fosforylované proteiny, které v extraktu ejakulovaných spermií nebyly nalezeny. Jelikož však bylo při naší práci možné provést jen omezený počet opakování, je pro zjištění přesnějších dat nutné některé experimenty zopakovat. Z celkových výsledků je zřejmé, že kapacitace je úzce spojena s tyrozinovou fosforylací na proteinech spermií. Nicméně je důležité zjistit, kde se přesně tyto proteiny ve spermii nachází a odhalit tak jejich další možnou funkci během následných kroků vedoucí k fúzi gamet.

Abstract:

Sperm capacitation and acrosomal reaction (AR) are processes that represent very dynamic processes necessary for oocyte fertilization in vivo or in vitro. During the capacitation, physio-logical changes occour associated with hyperactivation of sperm movement and preparation of sperm for fusion with an egg. Changes in sperm are controlled by activation of intracellular signaling pathways, which result in phospohyration on centrain proteins. The phosphorylation is one of the posttranslational modifications of proteins and phosphorylation on tyrosine is considered to b eone of the most important modifications associated with sperm capacitation, which leads to sperm interaction with ZP, induction of acrosomal reaction and membrane fusion. A evaluation and elucidation of all the mechanisms to which i tis associated can there-fore very significantly help in understanding of fertilization. The aim of the study was to describe changes in the phosphorylation of boar sperm proteins before in vitro capacitation, during capacitation and after the acrosomal reaction. The hypothe-sis was based on the assumption that differences in the localization and degree of protein phos-phorylation in ejculated and in vitro capacitated sperm and sperm after acrosomal reaction from native ejaculate and insemination dose will be detected. In this diploma thesis, tyrosine phosphorylation was evaluated by indirect immunoflu-orescence microscopy in boar sperm, a differnce in the proportion of phosphorylation patterns in sperm from native ejaculated and insemination dose was demonstrated. In vitro capacitated sperm, the phosphorylation pattern in the acrosome reaction, especially in sperm from the in-semination dose. No flag was phosphorylated in any of our experiments. Phosphorylation in the front of the head was noted in part of the pserm after AR. Furtermore, phosphotyrosine was detected in protein extracts by Western blot in boar sperm and markedly phosphorylated proteins with molecular weights of 28 kDa, 35 kDa and 41. kDa were detected. During the capacitation, we observed an increase in phosphorylation during the first two hours, after which the amount of phosporylated proteins decreased. It was interesting to icrease the rate of phosphorylation of a protein with a molecular weight of 28 kDa, especially in the later phase of capacitation. In addition, phosphorylated proteins were detected in capaci-tated sperm and sperm after AR., which not found in the ejaculated sperm extract. However, since it was possible to perform only a limited number of repetitions in our study, i tis necessary to repeat some experiments to obtain more accurate data. It is clear from the overal results that capacitation os closely related to tyrosine phosphory-lation on sperm proteins. However, i tis important to find out exactly where these proteins are located in the sperm and to reveal their further possible function during the sebsequent steps leading to gamete fusion.

Keywords

kapacitace, fosfotyrozin, tubulin, Western blot, imunofluorescence, akrozomální reakce

Keywords

capacitation, phospotyrosine, tubulin, Western blot, immunofluorescence, acrosome reaction

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 5. 2021

Thesis defence

• Supervisor: MVDr. Romana Krejčířová, Ph.D.
• Reader: Jana Antalíková, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology