Možnosti využití molekulárních metod pro studium populační genetiky raka říčního Astacus astacus

Jakub ŠABATA

Bachelor's thesis

Possibility of utilization of molecular methods for study of population genetics of noble crayfish Astacus astacus

Abstract:

Rak říční (Astacus astacus) je jeden ze dvou původních druhů raků žijících u nás, kteří jsou na celém našem území přísně chráněni, protože jsou označeni za kriticky ohrožený druh. V Evropě je to jeden z pěti původních druhů raků, zaznamenán organizací IUCN jako ohrožený druh, který potřebuje ochranný management. Jeho populace byly rapidně sníženy kvůli račímu moru, který přenášejí nepůvodní druhy raků ze Severní Ameriky, kteří byli v minulosti zavlečeni do Evropy a posléze i do České republiky. V minulosti byly izolovány a popsány mikrosatelitní markery pro raka říčního (Koiv a kol., 2008a). V rámci této práce bylo testováno použití těchto osmi mikrosatelitních markerů na vzorcích získaných z českých populací raka říčního. Testování jsme provedli na 53 vzorcích raků ze šesti populací. Testování vzorků bylo provedeno izolací DNA z tkáně třetí kráčivé končetiny pomocí DNA Lego Kitu. Následným ověřením izolátu DNA elektroforézou na agarózovém gelu. Testování teplotního cyklu PCR amplifikace vycházelo z původní publikace Koiva a kol. (2008a), následně byl PCR cyklus upravován podle kvality PCR produktů získaných v naší laboratoři. Jako nejvýhodnější byla zvolena teplota annealing primerů 60°C pro šest testovaných lokusů tj. Aas 3666, Aas 3115, Aas 790, Aas 1198, Aas 3950 a Aas 766, pro další dva lokusy Aas 2489 a Aas 3040 byla zvolena teplota annealingu 55°C. Výsledné produkty PCR byly testovány na agarózovém gelu a následně byly fragmentační analýzou na automatickém sekvenátoru Beckman Coulter CEQ8000 určovány délky PCR produktů v multiplexech složených z několika lokusů. V jednotlivých lokusech bylo v rámci našich 53 vzorků nalezeno od 1 do 13 alel ? jeden z lokusů byl monomorfní v rámci všech analyzovaných vzorků. Největší variabilitu ukázala moravská populace na Boskovické nádrži, průměrný počet alel na lokus 3,86, poté severočeská populace z Jaroměře 3,43 alel na lokus. Zelenohorská populace 3 alely na lokus a Světlohorská populace 2,57 alel na lokus. Nejnižší průměrný počet alel na lokus měla populace z Landštejna 2,43. Cílem této bakalářské práce bylo vypracovat literární rešerši o metodách molekulární biologie využívaných při studiu raků a zároveň ověřit možnost využití 8 dosud popsaných mikrosatelitních markerů pro raka říčního. V laboratorních podmínkách se podařilo úspěšně optimalizovat použití sedmi mikrosatelitních markerů z osmi popsaných. Tyto mikrosatelitní markery by měly být použitelné pro populační studie, a nebo pro určování rodičovství (otcovství) v reprodukčních experimentech. V rámci ověřování použitelnosti mikrosatelitních markerů byly vyhodnocovány i některé základní populační charakteristiky, optimalizace a testování použitelnosti mikrosatelitních markerů však bylo prováděno jen na velmi nízkém počtu vzorků, proto tyto charakteristiky mají pouze velmi omezenou vypovídací schopnost.

Abstract:

The noble crayfish (Astacus astacus) is one of two native species of crayfish living in this country who are all over our country strictly protecte, because they are identified as critically endangered species. In Europe it is one of five native species of crayfish, reported by IUCN as an endangered species that needs protection management. Its population was dramatically reduced due to crayfish plagues, which carry non-native crayfish species from North America, who were introduced in the past in Europe and later to the Czech Republic. In the past, have been isolated and described microsatellite markers for crayfish (Koiv et al., 2008a). As part of this work was tested using the eight microsatellite markers on samples obtained from the czech population of crayfish. Testing was performed on 53 samples from six populations of crayfish. Test samples were subjected to isolation of DNA from tissues of the third walking legs using DNA Lego Kit. Then test isolate DNA electrophoresis on agarose gel. Testing the temperature cycle of PCR amplification based on the original publication Koiv et al., (2008a), followed by PCR cycles were adjusted according to the quality of PCR products obtained in our laboratory. Primer annealing temperature 60°C was chosen as the best for six tested loci i.e. Aas 3666, Aas 3115, Aas 790, Aas 1198, Aas 3950 and Aas 766, for two other loci Aas 2489 and Aas 3040 was chosen 55°C annealing temperature. The resulting PCR products were tested on agarose gel and subsequently fragment analysis on an automatic sequencer Beckman Coulter CEQ8000 determining the lenght of PCR products in multiplex consisting of several loci. In the individual loci were in our 53 samples found from 1 to 13 alleles ? one of the loci was monomorphic in all samples analyzed. The moravian population in the Boskovice tank showed the greatest variability, the average number of alleles per locus 3.86, then the north bohemian population from Jaroměř 3.43 alleles per locus. Zelenohorská population of 3 alleles at a locus and Světlohorská population of 2.57 alleles per locus. The lowest average number of alleles per locus had a population from Landštejn 2.43. The aim of this bachelor thesis was to develop a literature search of methods use in molecular biology studies of crayfish and also validate the use of eight microsatellite markers have described for the noble crayfish. In laboratory conditions were succesfully optimized using seven microsatellite markers from the eight described. These microsatellite markers should be used for population studies, or for determining parentage (paternity) in breeding experiments. The verification of the applicability of microsatellite markers have been evaluate and some fundamental characteristics of the population, usability testing and optimization of microsatellite markers, however, was done only on a very small number of samples, because these characteristics have only a very limited explanatory power.

Keywords

mikrosatelit, alela, primer, PCR, fragmentační analýza, management ochrany

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 5. 2011

Identifier: 15150

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Pavel Kozák, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Bachelor programme / field:
Lifestock Breeding / Fishery