Analysis of nuclear proteins in plants

Mgr. Hana JEŘÁBKOVÁ

Disertační práce

Abstract:

Buněčné jádro je jedním z charakteristických organel eukaryotické buňky. Dvouvrstvá jaderná membrána představuje rozhraní mezi cytoplazmou a nukleoplasmou zahrnující chromatin, jadérko, jaderná tělíska a další struktury. Je protkána komplexem jaderných pórů a propůjčuje jádru důležitou regulační funkci. Proteiny představují nejpočetnější molekuly v buněčném jádře a poskytují strukturní a funkční rámec pro většinu procesů odehrávajících se v jádře. Ačkoli jaderné proteiny plní celou řadu důležitých funkcí, jejich znalost zůstává velmi omezená. U rostlin byl proteom buněčného jádra studován jen u několika modelových rostlin se známými genomovými sekvencemi a u několika hospodářsky významných plodin, u kterých byl sledován vliv stresových faktorů na změny jaderného proteomu. Cílem předkládané práce je studium jaderných proteinů rostlin a přispění k odhalení vztahů mezi strukturou a funkcí jádra rostlinné buňky. Záměrem je získat ucelený přehled o složení jaderného proteomu v jednotlivých fázích buněčného cyklu a charakterizovat funkci vybraných proteinů. Proteomická analýza byla provedena na jádrech kořenových špiček ječmene (Hordeum vulgare L. cv. Morex). Dřívější studie jaderných proteomů rostlin využívaly pro izolaci jader převážně frakcionační metody. Ty však s sebou nesou vysoké riziko kontaminace proteiny cytoplasmy a jsou časově náročné. Pro izolaci jaderných proteinů ječmene byl zde využit nový postup založený na třídění pomocí průtokové cytometrie. Průtoková cytometrie umožňuje poměrně rychlou analýzu mikroskopických částic, jako jsou buněčná jádra a mitotické chromozomy. Získané výsledky potvrdily vhodnost nového postupu, který umožňuje přípravu vzorků s minimální kontaminací nejadernými proteiny. S cílem identifikovat maximální počet proteinů byly použity dva typy měkkých ionizačních technik hmotnostní spektrometrie, MALDI-TOF/TOF a ESI-Q/TOF a ukázala se jedinečnost každého typu pro identifikaci určitých proteinů. Využití obou metod tak umožňuje pokrytí širokého spektra identifikovaných proteinů. Funkční analýza byla zaměřena na charakterizaci jaderného proteinu TPX2 (Targeting Protein for Xklp2), který náleží do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly. V živočišných buňkách působí TPX2 jako klíčový faktor pro proces nukleace mikrotubulů regulovaný RanGTPasou. Protein TPX2 po uvolnění z komplexu s importiny a aktivuje Aurora kinázu A, což je významný regulátor mitózy. Následně dochází k nukleaci mikrotubulů a tvorbě dělícího vřeténka. Bylo zjištěno, že TPX2 je asociovaný s kinázou Aurora1 také v rostlinných buňkách a že může působit jako regulátor kinázy Aurora1, která se podílí na organizaci mitotického vřeténka. K dalšímu objasnění funkce TPX2 byly analyzovány buňky Arabidopsis thaliana s nadprodukovaným TPX2. Nadprodukce vedla ke vzniku ektopických mikrotubulárních vláken v blízkosti jaderného obalu a uvnitř jádra. Nebyla prokázána spojitost mezi vytvářením mikrotubulárních svazků vlivem TPX2 a apoptózou, což odlišuje rostlinné buňky od buněk živočišných. Byla zjištěna interakce rostlinného homologu TPX2 s importinem což naznačuje účast Ran-GTPasové dráhy při formování mikrotubulů u acentrosomálních rostlinných buněk. Experimenty zameřené na regulační vztahy AtTPX2 a AtAurora kinázy 1 a 3 potvrdily AtTPX2 jako substrát, ale rovněž i aktivátor pouze u kinázy Aurora1. Aktivace kinázy Aurora1 pomocí AtTPX2 vedla ke zvýšené fosforylaci cílových proteinů, zvláště histonu H3. Odlišná regulace obou Aurora kináz může hrát významnou roli v regulaci procesů mitózy a buněčného cyklu. Ve svém souhrnu znamená předkládaná disertační práce přispění k id

Abstract:

Cell nucleus is one of the distinctive features of eukaryotic cell. Bi-layer nuclear envelope constitutes the interface between cytoplasm and nucleoplasm comprising chromatin, nucleolus, nuclear bodies and other substructures. The complex of nuclear pores imbedded in the envelope mediates the transport of macromolecules and confers the important regulation function. Proteins represent the most abundant molecules in the cell nucleus and provide structural and functional framework for the majority of nuclear processes. Although the nuclear proteins perform a large scale of functions, there is a limited knowledge about them. Within plant kingdom, the nuclear proteome has been studied in a few model plants and crop plants with known genome sequences in which the studies were aimed mainly at responses of nuclear proteome to stress factors. The aim of the Thesis is to study nuclear proteins in plants and to contribute to unraveling the relationship between the structure and function of plant cell nucleus. The intention is to obtain a comprehensive data on nuclear proteome in individual phases of the cell cycle and to characterise the function of selected proteins. In the proteomic analysis, nuclei from root tips of barley (Hordeum vulgare L. cv. Morex) were employed. The previous studies of plant nuclear proteomes have used predominantly fractionation methods for nuclei isolation. These are time-consuming and with a high probability of contamination with non-nuclear proteins. For the isolation of barley nuclear proteins, the new approach based on flow cytometric sorting was employed. Flow cytometry enables high speed analysis of microscopic particles such as intact cell nuclei and mitotic chromosomes. The obtained results proved the feasibility of this approach, which allows achieving a maximum yield and purity of specimen with a minimal contamination with non-nuclear proteins. For the protein identification, two types of soft ionisation mass spectrometry techniques were employed, MALDI-TOF/TOF and ESI-Q/TOF. The uniqueness of each technique has been showed and enabled the coverage of wide spectrum of identified proteins. Regarding the functional analysis, the aim of this Thesis was to contribute to the characterisation of nuclear protein TPX2 (Targeting Protein for Xklp2), which belongs to the group of microtubule associated proteins. Metazoan TPX2 is a key factor that promotes microtubule nucleation process regulated by RanGTPase. After releasing from the complex with importins and , TPX2 activates Aurora kinase A, an important mitotic regulator, which is followed by microtubule nucleation and spindle assembly. In plant acentrosomal cells, TPX2 protein was found associated with Aurora1, which was proved to organise spindle assembly process in plants as well. To clarify the function of TPX2 further, Arabidopsis thaliana cells with overexpressed AtTPX2 were analysed. The overproduction of AtTPX2 led to ectopic microtubular arrays in the nuclei and at vicinity of the nuclear envelope. Contrary to the animal cells, AtTPX2 mediated microtubule bundling was not a result of apoptosis. The interaction of plant TPX2 homologue with importin was detected, which suggests the participation of RanGTPase pathway in microtubule formation in acentrosomal plant cells. The evaluation of in vitro regulation patterns of AtTPX2 and AtAurora kinase 1 and 3 showed AtTPX2 as a substrate and activator of Aurora1, but not Aurora3. AtTPX2-induced activation of AtAurora1 enhanced phosphorylation of the downstream targets, particularly histone H3. These results may point to a specific regulation of plant Aurora1 and Aurora3 kinases, which may have its significance in regulation of processes in mitosis and the cell cycle. In brief, the present Thesis represents a contribution to progress in characterisation and revealing the function of plant nuclear proteins and constitutes the groundwork for further intensive study in this area.

Abstract:

entifikaci jaderných proteinů rostlin a odhalování jejich funkce a vytváří předpoklady pro další intenzivní studium v této oblasti.

Keywords

analýza proteinů, Arabidopsis thaliana, AtTPX2, Aurora kináza, buněčný cyklus, hmotnostní spektrometrie, jaderný proteom, jádro, importin, mikrotubuly, průtoková cytometrie, Ran, vlákna

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 10. 2015

Zveřejnit od: 12. 10. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Ing. Jaroslav Doležel, DrSc.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Botanika