Kvalita kryokonzervovaných inseminačních dávek starokladrubských hřebců

Bc. Aneta Martínková

Master's thesis

The quality of cryoconserved insemination doses of Old Kladruber stallions

Abstract:

Cílem práce bylo ověřit hypotézu, že na kvalitu kryokonzervovaných inseminačních dávek starokladrubských hřebců má vliv pořadí odběru ejakulátu, typ použitého ředidla a obalu. Ejakulát byl získán od hřebců plemene starokladrubský kůň (n = 6). Ejakulát hřebců byl odebrán a zpracován v akreditovaném reprodukčním centru koní ERC s.r.o., Pardubice, Mnětice, Česká republika. Po odběru byl ejakulát zředěn komerčním žloutkovým ředidlem Gent či laktózovým ředidlem. Takto naředěný ejakulát byl plněn do plastových pejet o objemu 0,5 ml nebo do aluminiových makrotub o objemu 5 ml a následně zmrazen. Inseminační dávky byly uloženy do kontejneru s tekutým dusíkem, kde byly uloženy až do rozmrazení a samotného hodnocení viability a morfologie. K hodnocení morfologie spermií byla použita barvící metoda dle Farrellyho. Z jedné inseminační dávky byly vytvořeny nátěry před kryokonzervací a po rozmrazení. Morfologické abnormality byly klasifikovány do předem stanovených kategorií. Pro hodnocení viability spermií bylo použito barviv eosinu a nigrosinu. Z jedné inseminační dávky byly po rozmrazení vytvořeny nátěry a v inkkubačních časech 0, 15, 30 a 60 minut. Pro obě hodnocení byl použit světelný mikroskop s imerzním objektivem. Data byla statisticky vyhodnocena pomocí programu Statistika (ver 12, StatSoft, ČR) na hladině významnosti P < 0,05. Z našich výsledků vyplývá, že pořadí odběru nemá vliv na viabilitu a morfologii spermií v nativním ejakulátu a vaibilitu v ejakulátu po rozmrazení. Pořadí odběru mělo vliv na výskyt morfologicky normálních spermií v ejakulátu po rozmrazení, přičemž vyšší výskyt normálních spermií bylo v posledním odběru. Ředidlo Gent má pozitivní vliv na počet živých spermií v nativním ejakulátu i ejakulátu po rozmrazení. V nativním ejakulátu byl prokázán pozitivní efekt laktózového ředidla na počet morfologicky normálních spermií oproti ředidlu Gent. Počet morfologicky normálních spermií v ejakulátu po rozmrazení byl srovnatelný pro obě ředidla. Typ obalu neměl vliv na viabilitu spermií po rozmrazení, ale měl vliv na výskyt některých morfologických abnormalit a vyšší počet morfologicky normálních spermií. Pro minimalizaci výskytu těchto abnormalit, je na základě výsledků této diplomové práce možné doporučit aluminiové obaly o objemu 5 ml.

Abstract:

The aim of this thesis was to prove the hypothesis that the quality of cryopreserved of insemination doses of Old Kladruby stallions is affected by the order collection, type of extender and packaging. The ejaculate was obtained from stallions of the breed Old Kladruby horse (n = 6). This ejaculate was collected and processed by the accredited center for horses reproductive ERC Ltd., Pardubice, Mnětice, Czech Republic. After collection, the ejaculate was diluted by commercial yolk extender Gent and lactose extender. The ejaculate was filled into plastic straws of 0.5 ml or into aluminum macrotubes of 5 ml and the ejaculate was frozen. Insemination doses were stored in container with liquid nitrogen, where they were stored until thawing and the evaluation of viability and morphology. For the evaluation of sperm morphology was used staining method according to Farrell. From one insemination dose were created samples before cryopreservation and samples after thawing. Morphological abnormalities were classified into predetermined categories. For evaluation of the viability of sperm were used stains eosin and nigrosine. From one insemination dose were created samples at times 0, 15, 30 and 60 minutes after thawing. For both ratings were used light microscope with immersion lens. Data were statistically analyzed using Statistics (ver 12, StatSoft, CR) at a significance level of P < 0.05. Our results show that the order in which samples are collected does not affect the viability and morphology of native ejaculate and viability of ejaculate after thawing. The order in which samples are collected does affect the occurrence of normal sperm morphology after thawing, the higher occurrence of normal sperm morphology was in final collection. Extender Gent has a positive effect on the number of live sperms in the native ejaculate and in the ejaculate after thawing. Positive effect of lactose extender was found to number of normal morphology sperms, against Gent extender. The number of normal morphology sperms in ejaculate after thawing were comparable for both extenders. Type of packaging did not affect viability of sperms after thawing, but had some effect on the occurrence of some morphological abnormalities. To minimize the occurrence of these abnormalities it would be preferable to use aluminum makrotubes of 5 ml.

Keywords

reprodukce, inseminační dávka, viabilita, morfologie, hřebec, kryokonzervace

Keywords

stallion, reproduction, insemination dose, cryopreservation, viiability, morphology

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jiří Šichtař, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction