Příprava transgenních linií vojtěšky (Medicago sativa) exprimujících markery cytoskeletu

Bc. Lucie ADAMCZYKOVÁ

Bachelor's thesis

Preparation of alfalfa (Medicago sativa) transgenic lines expressing cytoskeletal markers

Abstract:

Rostlinný cytoskelet plní v buňce rostliny nezastupitelnou úlohu. Tvoří oporu buňky, účastní se buněčného dělení, svou roli hraje při transportu vesikul nebo organel. Rostlinný cytoskelet reaguje na vnější podmínky, kdy při biotickém a abiotickém stresu dochází ke změnám v uspořádání aktinových filament a mikrotubulů. Ke změnám v uspořádání cytoskeletu dochází také během symbiotických procesů. Medicago sativa je rostlina spadající do čeledi bobovitých rostlin a vyznačuje se mimo jiné symbiózou s bakteriemi fixujícími vzdušný dusík. Aby bylo možné tyto procesy detailně studovat v živých rostlinných buňkách, je nutné rostlinný cytoskelet vizualizovat, a to nejlépe tak, aby nedošlo k narušení jeho dynamiky. Pro vizualizaci cytoskeletu pomocí fluorescenční nebo konfokální laserové mikroskopie se vyžívají fúzní fluorescenční proteiny, které slouží jako markery cytoskeletu. Cílem této bakalářské práce byla příprava Agrobacterium tumefaciens nesoucí konstrukty pro jednotlivé markery cytoskeletu jako lifeact:mCherry, tagRFP:TUA6, mRFPL:TUB6 a MAP4:GFP, a následně jimi stabilně transformovat listové explantáty M. sativa. Transformované rostliny byly regenerovány procesem somatické embryogeneze. V případě konstuktů lifeact:mCherry, tagRFP:TUA6 a MAP4:GFP byla ověřena jejich účinnost v M. sativa. Dále byla indukována somatická embryogeneze z listových explantátů transgenní rostliny, která již stabilně exprimovala konstrukt tagRFP:TUA6. V kořenech regenerovaných rostlin byla pozorována organizace kortikálních a mitotických mikrotubulů.

Abstract:

The plant cytoskeleton plays an irreplaceable role in the plant cell. It forms the backbone of the cell, participates in cell division and in the transport of vesicles or organelles. The plant cytoskeleton reacts on enviromental conditions. Biotic and abiotic stresses are responsible for rearrangement of actin filaments and microtubules. Changes in cytoskeleton organization can be also observed during symbiotic processes. Medicago sativa belongs to Leguminosae family and it is characterised by a symbiosis with nitrogen fixing bacteria. Visualization of the plant cytoskeleton without affecting it´s dynamics during in vivo observation is necessary for detail study of symbiotic processes. Cytoskeletal markers as a fusion proteins are used for visualization of the cytoskeleton by fluorescence or confocal laser microscopy. The aim of this thesis was to prepare A. tumefaciens curring construct for cytoskeleton markers: lifeact:mCherry, tagRFP:TUA6, mRFPL:TUB6, MAP4:GFP for stably transformation of M. sativa leaf explants. Transformed plants were regenerated by the process of somatic embryogenesis. In the case of constructs lifeact:mCherry, tagRFP:TUA6 and MAP4:GFP their efficacy in M. sativa was verified. Furthermore, somatic embryogenesis was induced from leaf explants of transgenic plant stably expressing tagRFP:TUA6 construct. An organization of cortical and mitotic microtubules was observed in the roots of regenerated transgenic plants.

Keywords

Transformace, Agrobacterium tumefaciens, Medicago sativa, cytoskelet, markery cytoskeletu, aktin, mikrotubuly

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 3. 6. 2019
• Supervisor: Mgr. Olga Šamajová, Dr.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering