Vliv vybraných ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy na signalizaci aryluhlovodíkovým receptorem (AhR)

Bc. Karolína POULÍKOVÁ

Master's thesis

The effect of selected ATP-competitive inhibitors of mTOR kinase on the signalization of aryl hydrocarbon receptor (AhR)

Abstract:

Aryluhlovodíkový receptor (AhR) je ligandy aktivovaný transkripční faktor zodpovědný za regulaci exprese enzymů metabolizujících xenobiotika. Aktivita tohoto receptoru je ovlivňována vazbou ligandu a posttranslačními modifikacemi, především fosforylací. V bakalářské práci jsem ukázala, že inhibice serin/threoninové kinázy mTOR látkou rapamycinem potencuje signalizaci AhR v přítomnosti ligandu. Signální dráha mTOR je zodpovědná za velké množství nitrobuněčných procesů jako jsou proliferace, apoptóza či organizace buněčného cytoskeletu. Deregulace této dráhy je spojená s procesem karcinogeneze, tudíž se její inhibice stala nadějí léčby nádorových onemocnění. V diplomové práci byl zkoumán vliv duálních ATP-kompetitivních inhibitorů mTOR kinázy, INK 128, AZD2014 a OSI-027, na signalizaci AhR v přítomnosti jeho ligandů v buněčné linii HepG2 odvozené od hepatocelulárního karcinomu. Nejprve byly určeny netoxické koncentrace testovaných látek metodou MTT a následně stanoveny inhibiční účinky na komplexy mTORC1/C2 metodou Western blotting. Úroveň aktivity AhR byla detekovaná metodou Gene reporter assay a enzymová aktivita CYP1A1 metodou EROD. Hladina CYP1A1 mRNA byla stanovena metodou real-time PCR. Bylo zjištěno, že komplex mTORC2 není za daných podmínek v buněčné linii aktivován, tudíž nebylo možné prokázat duální účinek inhibitorů. Kombinace testovaných látek s aktivátorem AhR 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinem (TCDD) potencovala transkripční aktivitu AhR a expresi CYP1A1 mRNA v závislosti na zvyšující se koncentraci látek. Byla také pozorována indukce katalytické aktivity CYP1A1, která ovšem s rostoucí koncentrací testovaných látek klesala. Samotné inhibitory mTOR neměly vliv na hladinu CYP1A1 mRNA, enzymovou aktivitu CYP1A1 ani na aktivitu AhR. Tato práce ukázala, že ATP-kompetitivní inhibitory mTOR kinázy potencují účinek aktivace AhR ligandem dioxinem a že mTOR signální dráha ovlivňuje regulaci AhR.

Abstract:

Aryl hydrocarbon receptor (AhR) is a ligand-activated transcription factor involved in regulation of xenobiotic-metabolizing enzymes. It is activated by ligands or posttranscriptional modifications, especially phosphorylation. In my bachelor thesis, I found that serine/threonine-specific protein kinase mTOR affected dioxin-inducible AhR-dependent CYP1A1 expression in the presence of mTOR inhibitor, rapamycin. AhR regulator which affects its signaling in the presence of ligands. mTOR signaling pathway is responsible for a large number of intracellular processes such as proliferation, apoptosis and cytoskeletal organization. Deregulation of this pathway is associated with a carcinogenesis and its inhibition can be considered as a cancer treatment. This thesis focuses on the influence of ATP-competitive inhibitors of mTOR, namely INK 128, AZD2014 and OSI-027, on signalisation mediated by the AhR in HepG2 cell line derived from hepatocellular carcinoma. Firstly, the non-toxic concentrations of the substances were determined by MTT method and then the inhibitor's effects on complexes mTORC1/C2 by Western blotting. The level of AhR activity was detected by Reporter gene assay and the enzymatic aktivity of CYP1A1 by EROD method. CYP1A1 mRNA levels were monitored by real-time PCR. Complex mTORC2 is not activated in the cell line under these condition. Therefore a dual effect of inhibitors was not proved. The substances were tested itself and in the combination with 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). The TCDD-inducible level of CYP1A1 mRNA and transcriptional activity of AhR were increased in the presence of mTOR inhibitors in dose-dependent manner. The induction of TCDD-inducible catalytic activity of CYP1A1 was also observed. However, it was decreased in dose-dependent manner of tested substances. mTOR inhibitors itself had no effect on CYP1A1 mRNA, CYP1A1 enzyme activity and AhR activity. The results suggest that ATP-competitive inhibitors of mTOR potentiate effect of AhR signaling activation in the presence of its ligand dioxin and that mTOR affects AhR signalling.

Keywords

Cytochrom P450, biotransformace, mTOR, rapamycin, posttranslační modifikace, ATP-kompetitivní inhibitory mTOR kinázy, INK 128, AZD2014, OSI-027

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Radim Vrzal, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology