Role transkripčního faktoru c-Myc v proliferaci, quiscenci, apoptóze a ribozomální biogenezi

Mgr. Agáta KUBÍČKOVÁ

Disertační práce

Role of Transcription Factor c-Myc in Proliferation, Quiscence, Apoptosis and Ribosomal Biogenesis

Anotace:

Předložená dizertační práce obsahuje tři výzkumné záměry, které se zaměřují na onkogen c-Myc. Při detailní charakterizaci biologických účinků triterpenů, odvozených z přírodních látek, jsme identifikovali spojitost mezi jejich protinádorovým účinkem a sníženou hladinou c-Myc. Vzhledem k zaměření našeho pracoviště na vývoj protinádorové léčby, včetně triterpenů, a možnosti využití robotické platformy pro vysokokapacitní screening, jsme vytvořili buněčnou linii s reporterem sledujícím hladinu transkripčního faktoru c-Myc. Při realizaci druhého záměru, jsme v rámci designu této linie zachovali lokus c-Myc s minimální modifikací, kterou bylo začlenění reporterové značky do C-koncové oblasti proteinu pomocí CRISPR/Cas9. Tím jsme zachovali fyziologickou expresi c-Myc a získali unikátní možnost sledovat dynamiku exprese obou hlavních izoforem c-Myc. Oba reportérové systémy byly podrobně popsány a ověřeny. Pro vysokokapacitní screening jsme optimalizovali podmínky a zvolili referenčního antagonistu, látku 10074-G5. Nyní provádíme primární screening komerčně dostupných chemických knihoven s cílem identifikovat látky, které snižují proproliferační funkce c-Myc na úkor těch podporujících quiscenci nebo buněčnou smrt. Během validace c-Myc reportérových linií jsme identifikovali další regulátory exprese těchto izoforem, transkripční faktor -katenin a ribozomální proteiny, vedle již popsaných kináz mTOR a PKR. Třetí část práce se zaměřuje na ribozomální biogenezi, která je významně ovlivněna c-Myc. Dokumentujeme patofyziologické projevy ribozomálního stresu při haploinsuficienci RPS7 a RPL11. Vytvořili jsme dva typy buněčných modelů: první pomocí siRNA knockdownu ke snížení exprese ribozomálních genů RPS7 a RPL11. Druhý odstraněním jedné alely RPL11 a vnesením bodové mutace pro RPS7 pomocí CRISPR/Cas9. Oba typy modelů vykazují patofyziologické projevy spojené s Diamond- Blackfanovou anémií a ribozomálním stresem. Přičemž pro studium konkrétních mutací je nezastupitelný buněčný model vytvořený CRISPR/Cas9. Tímto bychom rádi zdůraznili význam CRISPR/Cas9 technologie při vývoji buněčných modelů pro lepší porozumění patofyziologie vzácných onemocnění a následně pro nalezení nových terapeutických přístupů také pro onkologické malignity. V práci jsme rovněž shrnuli dosud známé informace o lokusu c-Myc a jeho izoformách s potenciálem v cílené terapii nádorových onemocnění.

Abstract:

This dissertation thesis contains three research projects focusing on the c-Myc oncogene. In a detailed characterization of the biological effects of triterpenes, derived from natural compounds, we identified a link between their anticancer effect and reduced c-Myc levels. Given our department's focus on the development of anticancer therapeutics, including triterpenes, and the possibility of using a robotic platform for highthroughput screening, we established a cell line with a reporter monitoring c-Myc transcription factor levels. In pursuit of the second goal, we retained the c-Myc locus within the design of this cell line with minimal modification, which was the incorporation of a reporter tag into the C-terminal region of the protein using CRISPR/Cas9. This preserved the physiological expression of c-Myc and provided a unique opportunity to monitor the expression dynamics of both major c-Myc isoforms. Both reporter systems have been described and validated in detail. For the high-throughput screening, we optimized the conditions and selected a reference antagonist, substance 10074-G5. We are now performing a primary screen of commercially available chemical libraries to identify agents that reduce c-Myc pro-proliferative functions at the expense of those that promote quiescence or cell death. During the validation of c-Myc reporter cell lines, we identified additional regulators of the expression of these isoforms, the transcription factor -catenin and ribosomal proteins, in addition to the previously described mTOR and PKR kinases. The third part of the thesis focuses on ribosomal biogenesis, which is significantly influenced by c-Myc. We document the pathophysiological manifestations of ribosomal stress in RPS7 and RPL11 haploinsufficiency. We established two types of cellular models: the first one by using siRNA knockdown to reduce RPS7 and RPL11 gene expression. The second one by disabling the expression of one allele of RPL11 and introducing a point mutation for RPS7 using CRISPR/Cas9. Both models show pathophysiological manifestations associated with Diamond-Blackfan anaemia and ribosomal stress. The cellular model generated by CRISPR/Cas9 is indispensable for studying specific mutations. With this, we would like to emphasize the importance of CRISPR/Cas9 technology in the development of cellular models for a better understanding of the pathophysiology of rare diseases and consequently for finding new therapeutic approaches also for cancer malignancies. In this thesis, we also summarized the previously known information about the c-Myc locus and its isoforms with potential in targeted cancer therapy.

Klíčová slova

c-Myc, buněčné modely, CRISPR/Cas9, regulace exprese, ribozomální proteiny, vysokokapacitní screening

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 1. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Onkologie / Onkologie