Exprese, purifikace a charakterizace cyanobakteriálních cytokinindehydrogenas

Hana CHUDOBOVÁ

Bachelor's thesis

Expression, purification and characterization of cyanobacterial cytokinin dehydrogenases

Anotácia:

Ireverzibilní degradace rostlinných hormonů cytokininů je katalyzována enzymem cytokinindehydrogenasou, který oxidativně štěpí N6 -postranní řetězec cytokininu. Výsledkem je tvorba adeninového derivátu a příslušného aldehydu. Cytokinindehydrogenasa byla objevena také u cyanobakterií. Cílem bakalářské práce bylo purifikovat a charakterizovat cytokinindehydrogenasu z cyanobakterií Scytonema hofmanni (ShCKX) a Chroococcidiopsis thermalis (ChtCKX). Pro expresi genů v Escherichia coli byly použity rekombinantní plasmidy pTYB12::ShCKX a pTYB12::ChtCKX. Nejprve byla provedena optimalizace podmínek exprese a následně izolace proteinů. Po izolaci byly proteiny purifikovány ve dvou krocích pomocí afinitní chromatografie a iontově výměnné chromatografie. Přítomnost cílových enzymů a jejich čistota byla hodnocena pomocí SDS-PAGE. Aktivita byla stanovena měřením absorbance Schiffovy báze vytvořeného aldehydu s p-aminofenolem při 352 nm. Enzym ChtCKX vykazoval velmi nízkou aktivitu, proto byl dále charakterizován pouze enzym ShCKX. Protein ShCKX má pH optimum v oblasti 8,0-9,0 a preferenčně štěpí cytokinin isopentenyladenosin.

Abstract:

Irreversible degradation of plant hormones cytokinins is catalysed by the enzyme cytokinin dehydrogenase, which oxidatively cleaves cytokinin N6 -side chain. As a result, the adenine derivative and the corresponding aldehyde are formed. Cytokinin dehydrogenase has also been found in cyanobacteria. The aim of this bachelor´s thesis was to purify and characterize cytokinin dehydrogenase from cyanobacteria Scytonema hofmanni (ShCKX) and Chroococcidiopsis thermalis (ChtCKX). Recombinant plasmids pTYB12::ShCKX and pTYB12::ChtCKX were used for the gene expression in Escherichia coli. The optimization of expression conditions was carried out first, followed by the isolation of proteins. After isolation, the proteins were purified in two steps using affinity chromatography and ion exchange chromatography. The presence of the target enzymes and their purity was assessed by SDS-PAGE. The activity was determined by measuring absorbance of a Schiff base of the formed aldehyde with p-aminophenol at 352 nm. The ChtCKX enzyme showed very low activity, therefore only the ShCKX enzyme was further characterized. The ShCKX protein has a pH optimum in the range of 8.0-9.0 and preferentially cleaves the cytokinin isopentenyladenosine.

Kľúčové slová

Cytokininy, cytokinindehydrogenasa, degradace, cyanobakterie

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 5. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 6. 6. 2019
• Vedúci: doc. RNDr. Jitka Frébortová, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / odbor:
Biology / Experimental Biology