Příprava proteinu pro TET-assisted pyridine borane sequencing

Bc. Adéla BURIANOVÁ

Master's thesis

Protein preparation for TET-assisted pyridine borane sequencing

Abstract:

Epigenetické modifikace se významně podílejí na regulaci genové exprese v živých organismech. Metylace cytozinů je jednou z nejlépe prostudovaných epigenetických modifikací DNA a její detekce má velký potenciál pro lékařské i forenzní účely. V průběhu let byla představena celá řada metod umožňujících detekci metylace cytozinu, a i nadále je tento směr oblastí intenzivního vývoje. Nejrozšířenější metodou detekce metylace DNA zůstává bisulfitové sekvenování i přesto, že přináší zkreslené výsledky v důsledku degradace analyzované DNA. Tento problém by mohl být překonán použitím metody TET asistovaného pyridin boranového sekvenování, která používá reakce šetrné k DNA. V průběhu TET asistovaného pyridin boranového sekvenování je DNA nejprve podrobena působení Tet enzymu, který převádí 5-metylcytozin na 5-karboxycytozin, který je v navazující reakci převeden na dihydrouracil působením pyridin boranu. Dihydrouracil je v následné PCR reakci čten a amplifikován jako tymin, což umožňuje rozlišení původního 5-metylcytozinu od původního cytozinu. Cílem experimentální části této diplomové práce bylo připravit rekombinantní mTet1CD enzym pro metodu TET asistovaného pyridin boranového sekvenování. Plazmid nesoucí sekvenci pro katalytickou podjednotku mTet1 enzymu značenou Flag značkou byl amplifikován v kompetentních bakteriích a izolován. Plazmidem byla transfekována savčí suspenzní buněčná linie Expi293 a mTet1CD protein byl exprimován. Cílový mTet1CD protein byl purifikován za využití afinitního gelu. Z 540 ml buněčné suspenze se podařilo získat 160 ?g mTet1CD enzymu, tedy množství použitelné pro 10 reakcí v metodě TET asistovaného pyridin boranového sekvenování. Kontrola úspěšnosti transfekce a průběhu purifikace proteinu byla provedena pomocí SDS-PAGE a Western blottingu. Při kontrole průběhu purifikace bylo zjištěno, že při purifikaci dochází z 3,5 % k degradaci připravovaného mTet1CD enzymu.

Abstract:

Epigenetic modifications are significantly involved in regulation of gene expression in living organisms. Cytosine methylation is one of the best studied epigenetic modifications and its detection has a great potential in terms of clinical diagnostics and forensic purposes. Many methods enabling detection of DNA methylation have been introduced over the years and detection of DNA methylation continues to be a field of intensive development. The most common method for detection of DNA methylation is bisulfite sequencing, despite its biased results caused by degradation of analyzed DNA. This limitation could be overcome by TET-assisted pyridine borane sequencing, which uses mild chemical reactions. During TET-assisted pyridine borane sequencing Tet enzyme is used to convert 5-methylcytosine to 5-carboxycytosine, which is then converted to dihydrouracil by pyridine borane reaction. In subsequent PCR reaction dihydrouracil is amplified as thymine enabling to distinguish the original cytosine from original 5-methylcytosine. The focus of the experimental part of my thesis is preparation of recombinant mTet1CD enzyme for TET-assisted pyridine borane sequencing. The plasmid carrying the sequence of mTe1 catalytic domain labelled by Flag-tag was amplified and isolated using competent bacteria. The mammalian suspension Expi293 cell line was transfected with the plasmid and mTet1CD protein was expressed. The Tet1CD protein was purified using affinity gel. I managed to gain 160 ?g mTet1CD enzyme from 540 ml of cell culture, which equals the amount of mTet1CD enzyme for 10 reactions in TET-assisted pyridine borane sequencing method. SDS-PAGE and Western blotting were used for the verification of transfection success and for the control of purification process. During the control of purification process it was discovered, that 3.5 % of the final mTet1CD enzyme was degraded.

Keywords

epigenetika, metylace cytozinu, 5-metylcytozin, TET asistované pyridin boranového sekvenování, Tet enzym, detekce metylace DNA, analýza metylomu

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology