Návrh a produkce tagovaných rekombinantních proteinů pro orientovanou vazbu na proteonanoliposomy.

Bc. Tereza FILIPI

Diplomová práce

Design and production of tagged recombinant proteins for oriented binding onto proteonanoliposomes

Anotace:

HIV neboli virus lidské imunodeficience je retrovirus, který u nakažených způsobuje terminální syndrom získané imunodeficience AIDS. Toto onemocnění a jiné problémy spojené s nákazou virem HIV stojí každoročně životy mnoho pacientů. Předložená práce se soustředí v teoretické části na shrnutí dosavadních poznatků v oblasti vývoje vakcíny proti HIV, představení rekombinantních proteinů jako klíčové komponenty vakcín a přibližuje jejich přípravu, včetně metod purifikace. Dále je zde popsána gp140 SOSIP varianta rekombinantního glykoproteinu Env identifikovaného u pacienta WEAU v chronické fázi HIV-1 infekce (označeného P4W) a liposomální nanočástice, použitelné jako nosič pro přípravu proteinových vakcín. V experimentální části byl připraven plasmid kódující glykoprotein gp140 SOSIP P4W s připojenou peptidovou coiled-coil kotvou a peptidovými značkami potřebnými pro purifikaci a identifikaci rekombinantního proteinu. Aby mohly být tyto značky později odstraněny, byla mezi gp140 SOSIP + coiled coil sekvenci a pomocné značky přidána aminokyselinová sekvence rozpoznávána endoproteasou enterokinasou (EC 3.4.21.9). Fúzní protein byl exprimován v HEK 293F linii savčích buněk, a následně purifikován pomocí afinitní chromatografie. Po zakoncentrování byl protein štěpen enterokinasou za optimalizovaných podmínek. Výsledný glykoprotein gp140 SOSIP P4W s coiled coil kotvou byl charakterizován základními fyzikálně chemickými postupy.

Abstract:

HIV, a human immunodeficiency virus, is a retrovirus that causes development of acquired immunodeficinecy syndrome AIDS. This disease and other HIV-related complicatons cost many people´s lives each year. The Master thesis summarize the development of HIV-1-preventing vaccine, followed by brief overview about recombinant proteins design, production, and purification. Next part describes the properties of HIV-1 envelope protein gp140 in soluble and structurally stabilized variant "SOSIP" from a patient "WEAU" in chronic stage of HIV-1 infection (designed as P4W). Last part of the introduction summarizes preparation and properties of liposome particles, which could be used as a carrier nanoparticles for recombinant proteins vaccines formulation. The experimental part describes the design of a plasmid coding for gp140 SOSIP P4W glycoprotein fused with a sequence for coiled-coil anchor and tags needed for purification and identification separated by sequence recognized by endoprotease enterokinase (EC 3.4.21.9). Next part describes expression of the recombinant protein in a mammalian cells line HEK 293F followed by purification using affinity chromatography. The purified protein was enzymatically cleaved under optimized conditions. The resulting gp 140 SOSIP P4W glycoprotein with coiled-coil motif was then characterized using physical-chemical methods.

Klíčová slova

rekombinantní protein, HIV, liposomy, Env, gp140 SOSIP P4W, coiled-coil, enterokinasa

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie