Využití dvoudimenzionální chromatografické separace peptidů v diferenční proteomice

Bc. Lenka NOSÁLKOVÁ

Master's thesis

Use of 2-dimensional chromatography separation of peptides in diferentional proteomics

Abstract:

Diferenční proteomika se zabývá studiem změn v proteomu buňky před a po definovaném působení na buňky. Abychom získali celkový náhled na proteom, je nutné využít vícerozměrnou analýzu, kdy je v posledních letech nejvíce používaná dvoudimenzionální chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií. Tato práce se zabývá optimalizací podmínek pro identifikaci a kvantifikaci co největšího počtu proteinů. Srovnávala se analýza různých počtů frakcí, typy gradientových elucí a typy experimentálních přístupů. Na základě všech získaných a prezentovaných dat bylo zhodnoceno, že nejvhodnější experimentální uspořádání pro analýzu komplexních vzorků zajišťuje mikrogradientová frakcionace na RP-C18 fázi s bazickou mobilní fází o pH 10, která dělila peptidy do 7 frakcí. Toto uspořádání je vhodné jak z hlediska identifikace peptidů a proteinů, tak z hlediska kvantifikace pro cílenou diferenční proteomickou analýzu. Kromě toho se testovalo, zdali se může gradientová HPLC-UV využít pro kvantifikaci peptidů ve vzorcích po proteolytickém štěpení. Došli jsme k závěru, že gradientová HPLC-UV je vhodná pro kvantifikaci peptidů a závislost množství peptidů a odezvy na UV detektoru je lineární a reprodukovatelná. Omezením metody je pouze požadavek, že je nutné připravit vlastní kalibrační závislost pro různé typy vzorků peptidů, tj. jednoduchý peptid, peptidy naštěpěpené z jednoho proteinu nebo komplexní směs naštěpená z celého lyzátu vybraného materiálu. Optimalizovaná metoda je využitelná.

Abstract:

In differential proteomics, changes in proteome of a cell before and after defined impact on cells are studied. To gain a full design of proteome, it is necessary to use multidimensional analysis, whereas in recent years the two-dimensional chromatography in combination with mass spectrometry is the most employed method. This work investigates the optimalization of conditions for identification and quantification of the highest number of proteins. We compared analysis of different number of fractions, types of gradient elution and types of experimental approaches. On the basis of gained and presented data, we evaluated that the most suitable experimental approach for analysis of complex samples is microgradient fractionation on RP-C18 phase with basic mobile phase with pH 10, which separated peptides in seven fractions. This approach is suitable for identification of peptides and proteins as well as in quantification for targeted differential proteomic analysis. Furthermore, we investigated if we can use gradient HPLC-UV for quantification of peptides in samples after proteolytic digestion. We concluded that gradient HPLC-UV is suitable for quantification of peptides and further that dependence of the amount of peptides and response on UV detector is linear and reproducible. However, there is a limitation in the necessity to prepare own calibrating dependence for different types of peptide samples (simple peptide, peptides digested from one protein or complex digest from full lyzat of the selected substance). The optimized method is utilizable.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 8. 2020

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. René Lenobel, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry