Role reaktivních částic kyslíku a proteinové fosforylace na rybí spermie

MSc. Ievgeniia GAZO

Doctoral thesis

The role of reactive oxygen species and protein phosphorylation in fish spermatozoa

Abstract:

Spermie druhů ryb s vnějším oplozením jsou po uvolnění do vodního prostředí zvláště citlivé na poškození hlavně kvůli změnám ve složení média v okolní spermatu. Mezi faktory ovlivňující pohyb spermií v externím médiu jsou: znečištěná voda, teplota, pH a osmotické podmínky. Cílem této studie bylo zjistit, účinky oxidačního stresu a možné následky související s výkonností spermií a intracelulární signalizací, zejména díky vlivu znečišťujících látek, vyskytujících se ve vodním prostředí. Navíc molekulární mechanismy stresových reakcí a aktivační proces pohyblivosti spermií byly analyzovány u více druhů sladkovodních ryb. Naše výsledky prokázaly, že xenobiotika, jako je Vinclozolin, mohou vyvolat snížení pohyblivosti a rychlosti spermií u jesetera malého (Acipenser ruthenus) již při koncentracích vyskytující se přirozeně ve vodním prostředí. Zvýšené hladiny lipidové oxidace (LO) a proteinové karbonylace (CP), stejně jako změny v antioxidačním účinku superoxid-dismutázy (SOD) poukazují na vývoj oxidačního stresu u spermií, které byly předem vystaveny xenobiotikům. Dále byla pozorována zvýšená fragmentace DNA a snížená úroveň ATP u spermií, které byly ovlivněny cizorodými látkami in vitro. Tyto výsledky naznačují, že spermie jesetera malého jsou velmi citlivé na přítomnost škodlivých látek a nadměrnou produkci ROS, které jsou vyvolány již při nízkých koncentracích. Další studie byly provedeny za účelem vyhodnotit úlohy produkce ROS u rybích spermií a potvrdit ochranné vlastnosti semenné tekutiny. ROS byl vygenerován inkubací kapřích (Cyprinus carpio L.) spermií in vitro s xanthin - xanthinoxidázou systémem (X-XO). Dávka škodlivé látky a doba působení měly vliv na snížení pohyblivosti a rychlosti spermií, stejně tak byla pozorována zvýšená hladina LO, CP a DNA fragmentace. Navíc bylo prokázáno, že O-spojeno s N-acetylglukosamin transferázou a septin-8-A změnil jejich stav fosforylace a kyselá fosfatáza v reakci na oxidační stres byla snížena. Na druhé straně, kataláza (CAT), superoxiddismutáza (SOD), glutathion a (GTH) v kombinaci se semennou plazmou má vliv na snížení oxidačního stresu u spermií kapra a zvýšení jejich kvality. Naše další studie byla použita ke stanovení, jak byly fosforylací proteiny pozměny po aktivaci pohyblivosti spermatu u kapra a jesetera, kde se fosforylované proteiny nacházejí ve spermatu a identifikované proteiny jsou zapojeny do procesu pohyblivost spermií. Ukázalo se, že typ proteinové fosforylace a její lokalizace se značně liší u obou druhů ryb. Fosforylace na serinovém a tyrosinovém zbytku, stejně jako protein-kináza A (PKA) a protein-kináza C (PKC) hrají důležitou roli u pohyblivosti, aktivace a regulaci spermií u obou druhů. Nespočet signalizačních proteinů podílejících se na pohybu spermií kapra a jesetera, byly identifikovány v této studii, a tudíž máme o krůček lepší pochopení molekulárních mechanismů u parametru pohyblivost spermií. Na závěr, výsledky této studie poskytují nové údaje o vlivu xenobiotik a oxidačního stresu na pohyblivosti rybích spermií, integritu DNA, lipidové a proteinové oxidaci, antioxidační obranný systém a intracelulární signalizaci. Naše údaje prokázaly toxicitu znečišťujících látek ve vodě a ROS u rybích spermií a navrhované využití CAT, SOD, nebo GTH v kombinaci se semennou plazmou pro snížení oxidačního stresu ve spermatu. Navíc bylo identifikováno mnoho proteinů ve spermiích, podílejících se na stresové reakci a pohyblivosti. Pro praxi, údaje uvedené v této práci, by mohly být užitečné pro zpracování médií vhodné pro kryoprezervaci a umělé rozmnožování různých druhů sladkovodních ryb.

Abstract:

Spermatozoa of externally fertilizing fish species after releasing into aqueous environment are particularly vulnerable to damage mainly due to alterations in composition of media surrounding sperm. Among factors affecting spermatozoa movement in external medium are water pollutants, temperature, pH and osmotic conditions. The goal of this thesis was to investigate the possible effects of oxidative stress on sperm performance and intracellular signaling, particularly the effect of pollutants occurring in water environment. In addition the molecular mechanisms of stress response and motility activation for spermatozoa of several freshwater fish species were analyzed. Our results show that xenobiotics, such as vinclozolin, induce a dose-dependent reduction in sterlet (Acipenser ruthenus) spermatozoa motility and velocity at environmentally relevant concentrations. Increased levels of lipid oxidation (LO) and protein carbonylation (CP), as well as changes in antioxidant activity of superoxide dismutase (SOD) indicate the development of an oxidative stress in spermatozoa exposed to xenobiotic. Moreover, increased DNA fragmentation as well as a reduction of the level of ATP was observed in spermatozoa incubated with xenobiotic in vitro. These results demonstrated that sterlet spermatozoa are highly susceptible to the presence of pollutants, which induce excessive ROS production even at low concentrations. Further studies were performed in order to evaluate the role of ROS production in fish sperm and protective properties of seminal plasma. The ROS were generated in carp (Cyprinus carpio L.) spermatozoa by in vitro incubation with xanthine - xanthine oxidase system (X-XO). A time- and dose-dependent reduction in spermatozoa motility and velocity was observed as well as increased LO, CP and DNA fragmentation. Moreover, it was shown that O-linked N-acetylglucosamine transferase and septin-8-A changed their phosphorylation state on tyrosine residue, and acid phosphatase activity decreased in response to oxidative stress. On the other hand, catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), and glutathione (GTH) in combination with seminal plasma can reduce oxidative stress in carp spermatozoa and improve sperm quality. Our next study was applied to determine how the protein phosphorylation pattern changed after motility activation in carp and sterlet spermatozoa, where phosphorylated proteins are located in spermatozoon and to identify proteins involved in sperm motility. It was shown that the pattern of protein phosphorylation and their localization differs significantly between two species. Phosphorylation on serine and tyrosine residues, as well as protein kinase A (PKA) and protein kinase C (PKC) substrates play an important role in spermatozoa motility activation and regulation in both species. Numerous signaling proteins involved in carp and sterlet spermatozoa movement were identified in this study, giving a better understanding of molecular mechanisms underlying sperm motility. As a conclusion, the results of this study provide new data on the effect of xenobiotics and oxidative stress on fish spermatozoa motility, DNA integrity, lipid and protein oxidation, antioxidant defense system and intracellular signaling. These data proved the toxicity of water pollutants and ROS for fish spermatozoa and proposed the use of CAT, SOD, or GTH in combination with seminal plasma to reduce oxidative stress in these cells. Moreover, we identified many spermatozoa proteins involved in stress response and motility. In practice, the data presented in this thesis could be useful for elaboration of suitable medium for cryopreservation and artificial propagation of freshwater fish species.

Keywords

Rybí spermie, oxidační stres, antioxidační enzymy, intracelulární signalizace, fosforylace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 9. 2015

Accessible from:: 3. 9. 2015

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery