Studium oxidačního stresu u včely medonosné (Apis mellifera) se zaměřením na karbonylaci proteinů

Bc. Kateřina KRÁLOVÁ

Master's thesis

Study of oxidative stress in the honey bee (Apis mellifera) focusing on protein carbonylation

Abstract:

Reaktivní formy kyslíku (ROS) jsou vysoce reaktivní molekuly, které jsou tvořeny během buněčných procesů. V organismu mají ROS duální charakter, při fyziologických hladinách se účastní buněčné signalizace nebo imunitní odpovědi, ale pokud jsou produkovány ve vysokých koncentracích dochází jejich vlivem k rozvoji oxidačního stresu. Oxidační stres je popsán jako nerovnovážný stav mezi tvorbou ROS a jejich eliminací antioxidačním systémem, ve prospěch ROS. Vlivem ROS dochází k oxidačnímu poškozování biomolekul, což může mít za následek předčasný úhyn organismu. U včel jsou ROS nadměrně produkovány vlivem různých biotických a abiotických stresových faktorů, jako je například působení pesticidů. V posledních dekádách došlo k významnému úhynu včelích kolonií, a to nejspíše vlivem několika různých faktorů. A jedním z možných faktorů je právě oxidační stres. Nejčastěji stanovovanými biomarkery oxidačního stresu jsou produkty oxidačního poškození nebo aktivita antioxidačních enzymů. Nejvýznamnější oxidační poškození proteinů je jejich karbonylace, takto poškozené proteiny lze stanovit například s využitím spektrofotometrických nebo imunochemických metod. V experimentální části práce byla nejprve optimalizována metoda pro stanovení karbonylovaných proteinů ve včelích vzorcích, konkrétně se optimalizovalo imunochemické stanovení metodou ELISA v nepřímém uspořádání a s využitím protilátky cílené na produkt reakce 2,4-dinitrofenylhydrazinu a oxidačně poškozeného proteinu. Pro optimalizaci metody byl využit standard karbonylovaného proteinu v podobě oxidovaného BSA a dále včely, u kterých byl indukován vznik oxidačního stresu. Po optimalizaci byla metoda ELISA využita pro analýzu oxidačního stresu u včel, které byly vystaveny stresovým faktorům v podobě pesticidů, kdy byl studován účinek herbicidu paraquatu (PQ) a jeho varianty MitoParaquatu (MitoPQ) cílící v buňce přímo na mitochondrie. V rámci analýzy oxidačního stresu u těchto skupin včel byly stanoveny i další biomarkery, tj. konečný produkt peroxidace lipidů malondialdehyd (MDA) a enzymová aktivita antioxidačního enzymu superoxiddismutasy (SOD). Ukázalo se, že doba expozice pesticidů nejspíše nebyla dostatečná pro rozvoj oxidačního stresu, který by se projevil formou oxidačního poškození, protože nebylo detekováno zvýšení hladiny karbonylovaných proteinů a koncentrace MDA oproti kontrolní skupině včel. Kdežto v rámci stanovení specifické aktivity SOD bylo pozorováno zvýšení aktivity SOD v hlavové části ošetřených včel oproti kontrole, což poukazuje na protekci nervového systému včel navýšením antioxidační kapacity. S tím, že aktivita u včel ošetřených PQ byla na obdobně vysoké úrovni jako aktivita u včel ošetřených 5krát nižší koncentrací MitoPQ. Tento poznatek poukazuje na násobně vyšší toxicitu MitoPQ v porovnání s PQ u včel. Dále byla při přípravě vzorků pozorována změna barvy obsahu medného volátka u MitoPQ včel, který by bylo vhodné analyzovat. S ohledem na získané výsledky byl realizován další experiment, kdy byl včelám aplikován vpichem induktor oxidačního stresu, tj. peroxidu vodíku. U takto ošetřených včel bylo detekováno snížení hladiny karbonylovaných proteinů a zvýšení aktivity SOD v hlavové části oproti kontrolní skupině, což může souviset s protekcí nervové soustavy včel. V této diplomové práci byl optimalizován protokol pro stanovení karbonylace proteinů u včel imunochemickou metodou ELISA, a také byl poprvé studován a popsán vliv MitoPQ na včelí organismus.

Abstract:

Reactive oxygen species (ROS) are highly reactive molecules that are formed during cellular processes. In the organism, ROS have a dual character, at physiological levels they are involved in cell signalling or immune response, but when they are produced in high concentrations they cause oxidative stress. Oxidative stress is described as an imbalance between the production of ROS and their elimination by the antioxidant system, in favour of ROS. ROS cause oxidative damage to biomolecules, which can result in premature death of the organism. In bees, ROS are overproduced due to various biotic and abiotic stress factors such as pesticide exposure. In recent decades, significant mortality of bee colonies has occurred, probably due to several different factors. And one of the possible factors is oxidative stress. The most commonly determined biomarkers of oxidative stress are oxidative damage products or the activity of antioxidant enzymes. The most significant oxidative damage to proteins is their carbonylation. Proteins damaged in this way can be determined, for example, using spectrophotometric or immunochemical methods. In the experimental part of this thesis, the method for the determination of carbonylated proteins in bee samples was first optimized, specifically, the immunochemical determination by indirect ELISA using an antibody targeted to the reaction product of 2,4-dinitrophenylhydrazine and oxidatively damaged protein. To optimize the method, a standard of carbonylated protein in the form of oxidized BSA as well as bees in which oxidative stress was induced were used. After optimization, the ELISA method was used to analyze oxidative stress in bees exposed to pesticides, where the effect of the herbicide paraquat (PQ) and its variant MitoParaquat (MitoPQ) targeting mitochondria directly was studied. Other biomarkers, i.e. the lipid peroxidation end product malondialdehyde (MDA) and the enzymatic activity of the antioxidant enzyme superoxide dismutase (SOD), were also determined in the analysis of oxidative stress in these groups of bees. It appeared that the pesticide exposure time was probably not sufficient for the development of oxidative stress to manifest as oxidative damage, as no increase in carbonylated protein levels and MDA concentration was detected compared to the control group of bees. Whereas, in the determination of specific SOD activity, an increase in SOD activity was observed in the head part of treated bees compared to the control, indicating protection of the bees' nervous system by increasing antioxidant capacity. With that said, the activity in PQ treated bees was at a similarly high level to that of bees treated with 5 times lower concentration of MitoPQ. This finding indicates a multifold higher toxicity of MitoPQ compared to PQ in bees. Furthermore, during sample preparation, a change in the colour of the crop content was observed in MitoPQ bees, which would be useful to analyse. In view of the results obtained, another experiment was carried out by injecting the bees with an oxidative stress inducer, i.e. hydrogen peroxide. In the bees treated in this way, a decrease in the level of carbonylated proteins and an increase in SOD activity in the head section were detected compared to the control group, which may be related to the protection of the nervous system of the bees. In this diploma thesis, the protocol for the determination of protein carbonylation in bees by immunochemical ELISA method was optimized, and also the effect of MitoPQ on the bee organism was studied and described for the first time.

Keywords

včela medonosná, reaktivní formy kyslíku, oxidační stres, karbonylace proteinů, paraquat, MitoParaquat

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 4. 2024

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Martina Janků, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry