Neuronální ceroidní lipofuscinóza způsobená mutací genu CLN6 u plemen psů využívaných pro canisterapii

Markéta Maroušková

Bachelor's thesis

Neuronal ceroid lipofuscinosis caused by mutation of the CLN6 gene in dog breeds used for canistherapy

Abstract:

Bakalářská práce je zaměřena na onemocnění neuronální ceroidní lipofuscinózy mutací genu CLN6 u plemene australský ovčák, které nachází své využití i jako pes vhodný pro canisterapii. Práce je rozdělena na dvě části. První část je věnována literární rešerši o nemoci, jejím mechanismu, zároveň srovnává různé genetické příčiny a symptomy u člověka a u psa. Neuronální ceroidní lipofuscinóza patří mezi poruchy metabolismu lysozomů v buňkách, též známé jako poliodystrofie. Dědí se autozomálně, převážně recesivně a projevuje se progresivními neurodegenerací. Mezi hlavní symptomy patří slepota, ztráta kognitivních a motorických funkcí a předčasná smrt. Fluorescenční mikroskopií jsou u nemocných jedinců pozorovatelné shluky lipopigmentů ceroidu a lipofuscinu, které se v lysozomech akumulují vlivem chybně fungující autofagie. Defekt způsobuje nesprávně translatovaný protein, specifický pro každý mutovaný gen.U člověka bylo zjištěno 16 kauzálních genů zapojených do nemoci a u psa 8 kauzálních genů. Nástup nemoci a její progrese byla u psů srovnatelná s projevy nemoci u člověka, pes se tudíž jeví jako vhodný model pro výzkum možných terapií, které by se daly aplikovat i na člověka. Druhá část práce byla věnována vlastnímu experimentu. Cílem bylo navrhnout funkční PCR-RFLP marker, kterým by bylo možné odlišit mutované a nemutované alely genu CLN6. Byla navržena dvojice primerů pro amplikon o velikosti 332 bp. Pomocí bioinformatické analýzy bylo zjištěno, že enzym FauI je schopen štěpit pouze mutovanou alelu v místě mutace (c.829T>C) na fragmenty o velikosti 195 a 137 bp. Navržený marker má kodominantní charakter - umí odlišit i heterozygoty (=přenašeče nemoci).Pro experiment se použily vzorky 20 psů, přičemž 1 z nich byl již dříve testován v jiné laboratoři jako přenašeč. Navrženým markerem se potvrdilo, že se jedná skutečně o heterozygota. Potenciálním heterozygotem mohl být i další pes, který je s tímto v příbuzenském vztahu. U tohoto vzorku byl však zřejmě chybně proveden odběr bukálních stěrů a během transportu došlo k degradaci DNA. Analýza u tohoto psa tudíž nemohla být provedena. Použitá metoda se i tak jeví jako účinná a je vhodná pro použití za účelem populační analýzy a zmapování výskytu mutované alely genu CLN6 u plemene australský ovčák v České republice.

Abstract:

The bachelor thesis focuses on the disease of neuronal ceroid lipofuscinosis caused by mutations of the CLN6 gene in the Australian Shepherd breed, which finds its use as a dog suitable for canistherapy. The work is divided into two parts. The first part is devoted to a literature research on the disease and its mechanism, at the same time it compares various genetic causes and symptoms in humans and dogs. Neuronal ceroid lipofuscinosis is a disorder of lysosome metabolism in cells, also known as poliodystrophy. It is inherited autosomaly, mostly recessively, and manifests as progressive neurodegeneration. Main symptoms include blindness, loss of cognitive and motor functions and premature death. Fluorescence microscopy reveals clusters of ceroid and lipofuscin lipopigments in diseased individuals that accumulate in lysosomes due to malfunctioning autophagy. The defect is caused by an incorrectly translated protein specific for each mutated gene. There were 16 causal genes involved in the disease in humans and 8 causal genes in dogs. The onset of the disease and its progression in dogs was comparable to the manifestations of the disease in humans, so the dog appears to be a suitable model for research into possible therapies that could be applied to humans. The aim of the second part was to design a functional PCR-RFLP marker that could distinguish mutated and non-mutated alleles of the CLN6 gene. A primer pair for a 332 bp amplicon was designed. Using bioinformatic analysis, the FauI enzyme was found to be able to cleave only the mutated allele at the mutation site (c.829T> C) into 195 and 137 bp fragments. The proposed marker has a codominant character - it can also distinguish heterozygotes (disease carriers). Samples of 20 dogs were used for the experiment, one of which had previously been tested in another laboratory as a carrier. The proposed marker confirmed that they were indeed heterozygous. Another dog whose case is related to this could also be a potential heterozygote. However, buccal swabs appear to have been incorrectly taken from this sample and DNA degraded during transport. Therefore, analysis for this dog could not be performed. The method used still appears to be effective and is suitable for use in population analysis and to map the occurrence of a mutated allele of the CLN6 gene in the Australian Shepherd breed in the Czech Republic

Keywords

pes domácí, Canis familiaris, neuronální ceroidní lipofuscinóza, australský ovčák, gen CLN6, PCR-RFLP

Keywords

dog, Canis familiaris, neuronal ceroid lipofuscinosis, Australian Shepherd, CLN6 gene, PCR-RFLP

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Animal Science / Animal-assisted Therapies and Activities