Studium imunomodulačních vlastností proteinů tepelného šoku

Mgr. Kateřina ZACHOVÁ

Doctoral thesis

Abstract:

Tato práce se zabývá studiem imunomodulačních vlastností proteinů tepelného šoku (hsp). Modelovým proteinem tepelného šoku byl zvolen hsp70, ke kterému byl na úrovni DNA pomocí ligace připojen protein p24 pocházející z kapsidy viru HIV. Gen kódující p24 byl připojen dvěma způsoby a to na 5´- nebo 3´- konec genu kódujicí hsp70 protein. Fúzní proteiny byly ligovány do prokaryontního expresního vektoru ChampionTM pET101 Directional (D) TOPO umožňující expresi v bakteriích E. coli a zároveň do eukaryontního vektoru pcDNA 3.1 D/V5-His TOPO umožňující expresi v eukaryontních buňkách a DNA vakcinanci. Plasmidy kódující fúzní proteiny byly aplikovány intramuskulárně do BALB/c myší. Buněčná odpověď byla analyzována pomocí průtokové cytometrie, zatímco specifické anti p24 protilátky byly stanovovány metodou ELISA. Proteiny p24, hsp70, p24-hsp70 a hsp70-p24 byly exprimovány v expresních liniích bakterií E. coli BL21 (DE3) a purifikovány pomocí metaloafinitní chromatografie. Jejich identita byla oveřena pomocí SDS PAGE elektroforézy, Western Blot analýzy a MALDI TOF hmotnostní spektrometrie. Jelikož byly purifikované proteiny určeny k vakcinaci, bylo nutné odstranit lipopolysacharidy (LPS) pocházející z buněčných stěn bakterií. LPS byly odstraněny několikanásobnou extrakcí do Tritonu X-114. Rekombinantní proteiny v ekvimolárním množství byly aplikovány intradermálně do BALB/c myší. Buněčná odpověď byla analyzována pomocí metody ELISPOT, zatímco specifické anti p24 protilátky byly stanovovány metodou ELISA. Paralelně byly izolovány a diferencovány nezralé myší dendritické buňky (BMDC), které byly pulzovány rekombinantními proteiny. Diferenciace a maturace dendritických buněk byla analyzována pomocí protilátek metodou průtokové cytometrie, zatímco internalizace antigenů do BMDC byla sledována pomocí konfokální mikroskopie.

Abstract:

This work focuses on the studying of immunomodulation properties of heat shock proteins (hsp). As the model protein the heat shock protein hsp70 was chosen. hsp70 was fused on the DNA basis with the p24 protein coming from viral capsid of HIV. The gene coding for p24 was ligated even to 5´- or to 3´- end of the hsp70 gene. Such fused proteins were ligated into the prokaryotic vector ChampionTM pET101 Directional (D) TOPO for bacterial expression in E. coli and simultaneously into the eukaryotic vector pcDNA 3.1 D/V5-His TOPO for eukaryotic expression or DNA vaccination. Plasmids coding for fusion proteins were applicated intramuscularly into BALB/c mice. Whereas the cellular immune response was analyzed by flow cytometry, specific anti p24 antibodies were determined by ELISA. Proteins p24, hsp70, p24-hsp70 and hsp70-p24 were expressed in expression lines of E. coli bacteria BL21(DE3) and purified by metalloaffinity chromatography. The identity was confirmed by SDS PAGE electrophoresis, Western Blot analysis and MALDI TOF mass spectrometry. Because the purified protein should be used for mice vaccination the lipopolysaccharide (LPS) coming from the bacterial cell walls needed to be removed. LPS was removed by several times extraction into Triton X114. Recombinant proteins in equimolar amount were applicated intradermally into BALB/c mice. Cellular immune response was analyzed by ELISPOT method and specific anti p24 antibodies were determined by ELISA. Parallelly, immature murine dendritic cells (BMDC) were isolated and differentiated. Immature BMDCs were pulsed by recombinant proteins. The cell differentiation and maturation was analyzed using antibodies by flow cytometry. Whereas the antigen internalization was observed by confocal microscopy.

Keywords

protein tepelného šoku, virus získané imunodeficience (HIV), p24 protein, prezentace antigenu, zkřížená prezentace, fůzní protein, vakcinace, dendritické buňky získané z kostní dřeně, Th1 a Th2 imunitní odpověď

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 10. 2015

Accessible from:: 5. 10. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 2. 12. 2015

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Immunology / Medical Immunology